药品无菌保证原理

第一部分微生物基础知识简介第2页,共62页，2024年2月25日，星期天一、微生物生存的环境人类生活的环境充斥着大量微生物海拔100英里（约160公里）以上海平面以下600英尺（约182米）的地方都可以发现微生物的踪迹1英里=5,280英尺或1.609公里第3页,共62页，2024年2月25日，星期天一、常见微生物种类基本特点细菌0.5～5μm，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢真菌5μm～50μm，形成芽孢随空气扩散，不耐热病毒小于0.1μm，一般不耐热，0.22μm过滤不了第4页,共62页，2024年2月25日，星期天一、真菌和细菌大小真菌5μm~50μm细菌0.5~5μm主要成员酵母、霉菌细菌细胞组成酵母是单细胞，其它为多细胞均为单细胞细胞质成份遗传物质(DNA)被双层核膜包裹(真核)，并且还有如线粒体、叶绿体及高卡基体等被膜包裹的细胞器。遗传物质(DNA)祼露并游离于细胞质内(原核)，并且不含有其它有膜细胞器。繁殖方式有性（如大型真菌或无性如酵母），霉菌则二者兼有无性（裂殖）孢子霉菌产生分生孢子（生长繁殖，类似于植物的种子)，虽不耐热，但会飘浮于空气中而难以消除。酵母不会产生孢子。主要只有两个属产生孢子（内生孢子），又名芽孢：Bacillus-芽孢杆菌属和Clostridium-梭菌属，细菌芽孢属于休眠体，一个细菌细胞产生一个芽孢生长条件20-25oC,3-5天30-35oC,1-2天杀灭程度不耐热，但难用消毒剂消毒（因孢子处于漂浮状态）生长态菌不耐热（极个别除外），但形成芽孢后耐热。第5页,共62页，2024年2月25日，星期天一、微生物分布特点微生物无处不在气源性微生物革兰氏阳性菌较多它们可形成芽孢，难以杀灭因此，药品生产需要HVAC水源性则革兰氏阳性菌居多不会生成孢子但会形成细菌内毒素耐热性差G+G-第6页,共62页，2024年2月25日，星期天一、生长态菌及孢子将植物比喻微生物，不恰当而直观如玉米，发芽→生长→种子，前二种相当于微生物的生长状态，到了种子，对环境的（水分、温度等）耐受性大大增强然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体，植物没有这种相对应的东西革兰氏阳性菌：气源性，身体上部，呼吸道革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。第7页,共62页，2024年2月25日，星期天一、细菌芽胞（孢）的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母细胞孢子壁的形成生长态细胞摘自/microbes/spores.asp内生孢子产生于Gram+

细菌:

芽孢杆菌属Bacillus

梭菌属Clostridium仅含核酸及少量萌发必需物皮层含DPA和Ca2+复合物能抵御各种恶劣环境可休眠上百万年真菌孢子因不具上述特性而不耐热DPA：吡啶二羧酸第8页,共62页，2024年2月25日，星期天一、生物指示剂（BI）的定义对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28）

特点用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性相用于被验证产品、灭菌工艺、生产工艺符合有关法规的要求第9页,共62页，2024年2月25日，星期天一、什么是芽孢？当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬的体眠体，该体眠体即称芽孢（Spore）或孢子。由于其对不良环境的耐受性远高于生长态细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被灭菌物品无菌的可靠性。第10页,共62页，2024年2月25日，星期天一、芽孢的特性主要产生于Gram+

细菌的两个属芽孢杆菌属Bacillus梭菌属Clostridium能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它有厚的皮层结构仅含核酸及少量萌发必需物含水量极低休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性。第11页,共62页，2024年2月25日，星期天芽孢的特点耐热80℃下长期存活100℃下有相当高的存活率100℃以上死亡过程符合一级动力学方程影响芽孢耐热性的因素芽孢存在的介质受热时的湿度第12页,共62页，2024年2月25日，星期天生物指示剂（BI）对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28）

特点芽孢用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性第13页,共62页，2024年2月25日，星期天第二部分

热力灭菌基本原理第14页,共62页，2024年2月25日，星期天

热对微生物的作用当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白质、酶及核酸时，细胞死亡。生命基本物质的破坏本质上是化学变化实验证明微生物受热死亡速度符合一级动力学方程第15页,共62页，2024年2月25日，星期天一级动力学方程式dN/dt＝K(N0－Nt)N0为t＝0时，存活的微生物数；

Nt为t时被杀灭的微生物数；

N为t时存活的微生物数

K为常数。对数规则第16页,共62页，2024年2月25日，星期天微生物存活数与灭菌时间关系图

半对数座标Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标tlgN102030123Y轴及X轴均为普通座标（示意）tN102030101001000第17页,共62页，2024年2月25日，星期天芽孢的耐热参数：D值指一定温度下将微生物杀灭90％或下降一个对数单位所需要的时间。lgNt1234t1t2D第18页,共62页，2024年2月25日，星期天灭菌温度对D值的影响灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长115℃121℃125℃lgNt△lgN=1D125D121D115第19页,共62页，2024年2月25日，星期天F0值：达到同一灭菌效果的概念

F0值即标准灭菌时间指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条件（121℃）相同灭菌效果的曝热时间lgNtLgNoLgNt121℃117℃△LgNFTFo第20页,共62页，2024年2月25日，星期天不同灭菌温度下的灭菌率灭菌温度℃灭菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59灭菌率：为达到与某一温度下灭菌1分钟相同的灭菌效果，在121℃下灭菌所需要的灭菌时间

100℃灭菌时1分钟，相当于121℃灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟。105℃灭菌40分钟时，Fo约为1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位第21页,共62页，2024年2月25日，星期天第三部分

药典对最终灭菌产品的无菌标准第22页,共62页，2024年2月25日，星期天无菌检查的局限性历史的教训：1962年，美国FDA颁布第一部GMP1970-1975年，美国输液污染至败血症400多起

--有问题的产品全部通过了无菌检查无菌检查的风险（另稿有示例说明）取样量为20瓶时污染率与通过无菌检查概率的关系批产品污染率％5101520通过无菌检查的概率％361241第23页,共62页，2024年2月25日，星期天药典对无菌保证的定量标准1973年的英国药典和1980年USP增补版提到了无菌的量化标准Fo不小于8分钟经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百万分之一。中国药典在2000版起，收载了此标准。无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经灭菌后，产品的无菌保证值不小于6第24页,共62页，2024年2月25日，星期天lgN2345-2-3-41-5-6-101234576891012分11SAL＝F0/D–lgN0

假定D121为1无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系过度杀灭示意生产中Fo=8示意第25页,共62页，2024年2月25日，星期天“无菌”的标准及概念“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。量化指标+计算+试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准

第26页,共62页，2024年2月25日，星期天产品灭菌完全的必要措施

从公式

SAL＝F0/D–lgN0看灭菌完全的必要措施足够的F0值产品灭菌前污染菌检测需氧菌总计数（微生物污染水平）污染菌耐热性第27页,共62页，2024年2月25日，星期天产品灭菌完全的必要措施-2通常采用的中间控制手段：对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。样品须作需氧菌总计数将检品液置于100℃下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢存活须对微生物学检测结果进行趋势分析。第28页,共62页，2024年2月25日，星期天产品灭菌完全的必要措施-3

FDA要求－“对于在灭菌前产品污染菌检测中所发现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用生物指示剂的耐热性进行对比”第29页,共62页，2024年2月25日，星期天产品灭菌完全的必要措施-4具体要求：如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热性，则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工艺重新进行验证(可以使用生产中的分离菌)。如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那么，这种情况发生的概率是非常小的。第30页,共62页，2024年2月25日，星期天无菌保证水平举例假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（D）为1分钟，要达到药典规定的SAL不小于6的标准，灭菌F0值应达到多少？相当于121℃和115℃下灭菌多少分钟？答：F0=（SAL＋lgN0）×D=（6+lg100）×1=8分钟，需在121℃下灭菌8分钟。换算成115℃下的灭菌时间是：F0/L115=8/0.25=32分钟。第31页,共62页，2024年2月25日，星期天某复方氨基酸注射液采用110℃，30分钟的灭菌程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，D值为0.5分钟，请计算无菌保证值和残存微生物污染的概率。答：其SAL为：SAL=F0/D-lgN0=L110×t/D-lg100=0.08×30/0.5-2=2.8残存微生物的概率为10-2.8＝0.158％通过无菌检查的概率为(1-0.158％)20=96.9%。无菌保证水平举例二第32页,共62页，2024年2月25日，星期天第四部分

注射剂常见灭菌方法第33页,共62页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌-1湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式）实际上只要微生物处于达到水－水蒸气平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入1ml水并密封。水分的存在有利于灭菌第34页,共62页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌特点蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞蒸汽热穿透性强灭菌效率高温度相对较低灭菌时间相对短灭菌过程不产生任何化学物理污染灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理第35页,共62页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌工艺之一美国FDA规定的残存概率法灭菌过程8≤F0<12分钟适用于热稳定性不很好的产品通过控制工艺过程的微生物污染和灭菌工艺参数使产品无菌无菌保证值不小于6第36页,共62页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌工艺之二过度杀灭法F0不低于12热稳定性好的产品以彻底杀灭任何污染的微生物为实现无菌的手段无菌保证值不小于6第37页,共62页，2024年2月25日，星期天其它湿热灭菌工艺？F0值低于8的灭菌工艺热稳定性很差的产品以无菌生产工艺为基础，灭菌是提高无菌保证水平的辅助手段不计算F0值，污染概率不大于0.1%除血液制品外，发达国家这类大容量注射剂几乎没有小容量注射剂也少见第38页,共62页，2024年2月25日，星期天无菌灌装与流通蒸汽灭菌PDA《参数放行》-1999-10-21文件中指出：如果产品在最终灭菌前采取无菌灌装，那么该产品的灭菌工艺可以采用较小的F0值（如F0≤8min）这当然是对热稳定差的产品采用的方法此提法和欧盟GMP无菌药品附录一致这一原则还没有被我国制药行业所认可，我国企业只认可流通蒸汽灭菌，却忽视了无菌制造工艺的关键要求第39页,共62页，2024年2月25日，星期天不同工艺无菌保证比较表过度杀灭法Fo>1210-6热稳定性好的产品以杀灭微生物作为实现无菌的手段残存概率法Fo>810-6热稳定性较差产品工艺过程将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是仅依赖最终灭菌去消除污染

流通蒸汽法不计算Fo0.1%热不稳定产品加热是无菌生产工艺（除菌过滤）的补充手段除菌过滤法LRV>70.1%不能加热的产品LRV=logreductionvalue过滤对数下降值，一般上游为107下游为1，则LRV=7由于后续无菌操作较多，最终产品达到的无菌保证水平远低于除菌过滤的本身的能力第40页,共62页，2024年2月25日，星期天干热灭菌机理干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，符合“对数规则”，但灭菌的机理却并不相同。干热灭菌为何需较高的温度？水份的影响：湿度低机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不是使蛋白质变性第41页,共62页，2024年2月25日，星期天干热灭菌要点干热灭菌的介质通常是热空气用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差温度高，200℃以上，有可能到320℃用于玻璃容器、手术器械等无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源第42页,共62页，2024年2月25日，星期天干热灭菌与去热原的关系去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间FH

的数十倍。如果干热法去热原工艺能使细菌内毒素下降3个对数单位，就不必再进行微生物的生物指示剂挑战性试验。第43页,共62页，2024年2月25日，星期天第五部分

灭菌工艺的验证第44页,共62页，2024年2月25日，星期天灭菌工艺的验证灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注册的必报材料灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同）灭菌工艺验证资料包括灭菌设备的安装确认灭菌设备的运行确认灭菌工艺的验证先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准空载热分布－找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验－产品获得的F0生物指示剂验证-微生物挑战性试验第45页,共62页，2024年2月25日，星期天灭菌过程的Fo示意第46页,共62页，2024年2月25日，星期天热力灭菌常用生物指示剂灭菌方式微生物（孢子）D值范围（分）湿热121℃嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus

1.5-3.0枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis

0.3-0.7凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans

0.4-0.8梭状芽孢杆菌Clostridiumsporogenes

0.4-0.8干热150℃枯草芽孢杆菌黑色变种

Bacillussubtilisvar.niger

>1.0资料来源：参数放行专题材料第47页,共62页，2024年2月25日，星期天第六部分

常见灭菌设备介绍第48页,共62页，2024年2月25日，星期天灭菌设备1、混合蒸汽灭菌柜2、下排式蒸汽灭菌柜3、脉动真空蒸汽灭菌柜4、旋转喷淋灭菌柜5、隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图第49页,共62页，2024年2月25日，星期天混合蒸汽灭菌柜SAM=steamairmixture蒸汽空气混合灭菌柜混合汽体灭菌柜进蒸汽的管没画出顶上用一风扇，使灭菌均匀无风扇时，灭菌容易不均匀热交换器控制冷却速度第50页,共62页，2024年2月25日，星期天下排式蒸汽灭菌柜热蒸汽在上冷空气在下蒸汽挤空气第51页,共62页，2024年2月25日，星期天脉动真空蒸汽灭菌柜有高真空及脉动真空二种形式第二种比较常见抽99%，剩1%3次真空，残存的空气为0.1%密封圈第52页,共62页，2024年2月25日，星期天旋转喷淋灭菌柜纯化水或注射用水作传热介质-过热水灭菌加热时开工业蒸汽冷却时，可用冷冻水或自来水冷却产品转动，受热均匀软袋灭菌时，用过热水较多，但需加压缩空气第53页,共62页，2024年2月25日，星期天干热灭菌柜常见程序：180×2小时，细菌内毒素下降3对数单位第54页,共62页，2024年2月25日，星期天隧道式洗瓶灭