中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识

中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断共识2013V1.0中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识目的：提高我国ALK融合基因型肺癌的个体化精准治疗能力

（precisiontherapy）非小细胞肺癌的个体化靶向治疗：伴随分子诊断是前提虽然ALK融合基因阳性患者仅占NSCLC的5%，但是总体患者负荷较大，治疗需求迫切ALK融合基因阳性NSCLC具有独特临床&病理、治疗和预后特征，已成为NSCLC中的一个分子亚型第一个ALK抑制剂克唑替尼已获得SFDA的批准（2013.01）中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识总体原则综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子分析方法的特点、实验室自身条件，需要多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证ALK融合型肺癌的检出率和准确率从临床诊断角度出发，综合最新的研究数据，并结合SFDA批准的伴随诊断方法，定期更新，保证检测结果的可信性和临床实际可操作性ALKprevalenceinChinaAuthorALKincidencePublicationsZhangX,WuYLetal.11.6%(12/103)MolCancer2009Wong,etal.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer2009LiH,ChenHQ,etal.3.0%(7/230smokers,AC)LungCancer2012SunY,ChenH,JiH,etal.5.8%(3/52surgicalAC,non-smokers)JCO2010WuSG,YangPC,etal.(Taiwan)34%(39/116,AC,WTEGFR)JTO2012RikovaK,etal4.7%(6/137)Cell2007WangZ,WangJ,etal.9.7%(11/113,StageIV)Oncology2012RenS,ZhouC,etal.9.6%(10/104,Female,AC,non-smoker)CellBiochemBiophys.2012;Cancer2012[GLCIinternaldata:7%(70/977);7.7%(31/400)]ALK阳性NSCLC总患者数约为HER2阳性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多ALK阳性肿瘤患者34,820例乳腺癌HER2阳性患者49,631例驱动突变肿瘤的每年发病数中国肿瘤登记年报，2012CML10,000例左右中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识ALK阳性vsEGFR突变vsNSCLC病因临床&病理特征患者预后治疗方法ALKvsEGFR：不同的驱动基因EML4EML4–ALKvariant1HELP1496981WDBasic14961059110581620TMKinaseALKEML4–ALK变体1激酶ALK融合基因驱动EGFR突变驱动临床&病理特征：ALK融合vsEGFR突变特征EGFREML4/ALK组织学腺癌TTF1+腺癌TTF1+亚型非粘液型粘液型吸烟状态不吸烟不吸烟人种东亚所有人种发病年龄66y52y性别女性男>女ALK阳性NSCLC与EGFR突变NSCLC与EGFR突变患者相比，ALK阳性NSCLC患者发病年龄更轻，更偏重于男性AT.Shaw,etal.JClinOncol.2009;27:4247-4253CharacteristicALK(n=19)EGFR(n=31)WT/WT(n=91)PNo.%No.%No.%ALKvEGFRALKvWT/WTAge,yearsMedianRange5229-766636-906429-87

<.001<.005SexMaleFemale1185842823267429623268.036.039SmokinghistoryNeversmokerLightsmokerSmoker1450742602164681913241552261657.366<.001EthnicityAsianNon-Asian0190100229694784892.519.602PathologyAdenoBAC†AdenosquamousSquamousLargecell/NOS1621008411500247000772300049323255435326.380*.686*与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻ALK融合与EGFR突变NSCLC的病理类型不同分型病例数EGFR突变Marchettietal.非粘液型粘液型691722（32）0（0）Tametal非粘液型粘液型19515（79）0（0）Sakuma,etal非粘液型粘液型17915（88）2（22）ClinCancerRes2009：20例发现ALK融合的肺腺癌中82%病例的癌细胞中包含粘液成分71%病例中，>10%的肿瘤细胞中含大量粘液成分ALKTRIBUTE研究亚组分析：EGFR突变患者预后较好ALK阳性NSCLC患者的预后更差ALK阳性vsALK阴性YangP,etal.JThoracOncol.2012;7:90–97YearssincediagnosisPFS/RFS曲线FISH(positive)versusFISH(negative)YearssincediagnosisPFS/RFS曲线IHC3(positive)versusIHC0/1(negative)ALK阳性vsEGFR突变vsNSCLCALK阳性EGFR突变驱动基因ALK融合基因EGFR突变临床&病理特征年轻、腺癌（粘液型）、不吸烟东亚裔、腺癌（粘液型）、不吸烟患者预后差好治疗方法克唑替尼EGFR-TKIsALK阳性非小细胞肺癌已成为NSCLC特定的亚型不同的驱动基因不同的患者预后不同的治疗方法不同的临床&病理特征AT.Shaw,etal.JClinOncol,2009中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识专家组推荐命名：根据专家的讨论，从检测方法学角度考虑到ALK融合型肺癌不仅是基因序列层面的改变，ALK融合蛋白也是该类疾病中的重要变异，因此将此类疾病统称为ALK阳性非小细胞肺癌中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识专家组推荐定义：ALK阳性非小细胞肺癌：是指包括ALKFISH检测阳性、ALK序列融合变异或ALK融合蛋白表达阳性的肺癌，肿瘤细胞中存在ALK融合基因表达，是非小细胞肺癌的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识是否需要富集人群检测ALK：EGFR突变？EGFR与ALK双突变的存在：5%-13%EURTAC研究中：双突变概率15.8%（RT-PCR法）有文献报道，双突变患者克唑替尼治疗有效是否需要富集人群：临床因素如果按照临床因素富集，将漏诊33%（2/6）的ALK阳性患者YoshikoMurakami,etal.FrontiersinOncology.2012;doi:10.3389/fonc.2012.00024是否需要富集人群：病理因素如按病理因素富集：可能会遗漏30%(5/17)的ALK阳性患者中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK检测适宜人群——专家组推荐：可优先在病理组织学特点富集的优势患者中进行ALK分子检测但单纯依靠临床特征与病理分型选择适宜人群并不能完全包括所有的ALK阳性NSCLC患者，对于潜在怀疑存在ALK融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK检测适宜人群——专家组推荐：可优先在病理组织学特点富集的优势患者中进行ALK分子检测但单纯依靠临床特征与病理分型选择适宜人群并不能完全包括所有的ALK阳性NSCLC患者，对于潜在怀疑存在ALK融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识NSCLC活检组织标本阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK检测流程图——专家组推荐：适合ALK融合基因诊断的肿瘤样本，包括各种组织样本和细胞学标本。组织标本获取手段包括手术标本、支气管镜、经皮肺穿刺、淋巴结活检、手术活检等对于恶性胸腔积液、心包积液、痰液或支气管灌洗液、细胞学穿刺和外周血肿瘤细胞等样本，在细胞数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块（cellblock），检测方法可采用FISH或IHC如果是新鲜细胞标本可考虑采用特异性PCR方法。考虑到细胞学样本的细胞数量少等特点，细胞学标本的检测结果解释需格外谨慎NSCLC活检组织标本阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测采用高灵敏度的检测系统后，有越来越多的数据支持使用IHC作为初步筛查灵敏度和特异度都可达到100％，但是不同研究间有差异与FISH相比，IHC是一种更常规的技术，成本更低，且工作强度也更低ALKIHCFISH患者1：IHC显示ALK强表达，FISH显示重排患者2：IHC显示无ALK表达，FISH显示无重排IHC用于检测ALK表达Mino-Kenudsonetal.,ClinCancerRes2010;16:1561–1571.常规IHC的抗体选择常规IHC敏感性高（假阴性率低），特异性低（假阳性高），因此建议IHC阳性患者（无论1+，2+，3+）均需FISH、RT-PCR、VentanaIHC确诊）EThunissen,etal.VirchowsArch(2012)461:245-257常规IHC与FISH的吻合性良好研究病例数FISHIHC3+IHC2+IHC1+IHC0Yi2011101阳性8110阴性022069Paik2011640阳性22600阴性01016586Park2012262阳性91150阴性021234JH,Paik2012735阳性151300阴性0720680XHan119阳性37710阴性21566Total1857阳性913870阴性222621635A.J.Weickhardt,etal.Cancer.2012Dec20.doi:10.1002/cncr.27913Total1857阳性913870阴性222621635价格便宜，适合于NSCLC患者的筛选操作流程简单、易行判读标准主观操作流程需标准化优势IHC（3+）与FISH（+）符合率98%劣势IHC（2+）与FISH（+）符合率63%IHC（+）与FISH（+）符合率10%IHC（-）与FISH（-）符合率100%ALK常规IHC与克唑替尼疗效存在相关性EL.Kwak,etal.NEnglJMed2010;363:1693-1703IHC阳性，FISH阴性克唑替尼治疗有效54岁，女性，腺癌IHC阳性（左图）FISH阴性（右图）ROS1与cMET均阴性Crizotinib250mgbid治疗有效，肿瘤PRJMSun,etal.JThoracicOncol,2012CaseReportIASLC/CAP/AMP，2013

肺癌分子检测指南ALKIHC检测，如经过仔细确认，可考虑作为ALKFISH诊断前的筛选方法NILindeman,etal.2012CAP,doi:10.5858/arpa.2012-0720-OA常规手动IHC注意事项及判读标准“采用IHC法需注意以下两点。第一，由于ALK的蛋白表达与神经外胚层的分化有关，故其可能在小细胞肺癌和正常人的脑组织中存在表达。因此，不建议在小细胞肺癌中使用ALK融合蛋白的IHC检测。第二，IHC的阳性标准判定尚未统一。常规IHC判读标准如下：IHC3+：>5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色；IHC2+：>5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色；IHC1+：>5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或≤5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；IHC0：肿瘤细胞无着色。”EThunissen,etal.VirchowsArch(2012)461:245-257NSCLC活检组织标本阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测ALK分离探针FISH原理3-ALK探针杂交端粒的断点大约是300KB，并用橘色荧光标示。5-ALK探针杂交着丝粒的断点大约是442kb，并用绿色荧光标示。VysisALKBreakApartFISHProbeKit.06N38-020,30-608495/R2FISH诊断橘红色与绿色探针相互临近或粘合：ALK阴性橘红色与绿色探针相互分离或单个橘红色探针：ALK阳性FISH检测的局限性结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读晚期患者小活检标本(2mm)，很难保证每个视野存在50个癌细胞价格昂贵，2600元左右/例，无法适用于筛选FISH检测的优势目前，临床研究的结果均是以FISH为检测手段Falsepositivityvsfalsenegativity....Split-signalFISH:Fusion-signalFISH:Translocation-positiveTranslocation-negativeFalse-positiveFalse-negativeMicroscope:Sle/nucleus:Slide:在ALK融合阴性的患者，免疫组化显示无ALK表达。RT-PCRFISH：进行VysisLSIALK双色打散FISH探针检测到ALK融合（分裂的红色和绿色信号）。对AmoyDxEML4-ALK融合基因检测，实时RT-PCR显示deltaRn对PCR循环数的变化。在ALK融合阳性的患者，免疫组化显示ALK表达。RT-PCR临床检测数据：腺癌发生率7.7%CharacteristicsEML4-ALKMutation,N(%)Wildtype,N(%)PAge,years≥60<609(3.6)19(7.9)240(96.4)220(92.1)0.040SexMaleFemale9(3.1)19(9.8)286(96.9)174(90.2)0.002StageIAIBIIAIIBIIIAIIIBIV12(9.0)4(2.9)2(33.3)1(2.3)9(5.5)00122(91.0)132(97.1)4(66.7)42(97.7)156(94.5)130.036bHistopathologyADSCCAD-SCCeOthers25(7.2)2(2.0)1(5.6)0324(92.8)99(98.0)17(94.4)200.053dDifferentiationPoorGoodUnidentified8(6.3)17(5.0)3(12.5)119(93.7)320(95.0)21(87.5)0.594SmokingstatusNoYesUnknown21(8.2)4(2.6)3(4.0)236(91.8)152(97.4)72(96.0)0.021fProbailityofdisease-freesurvival1.00.80.60.40.20.06.018.012.024.0Time(months)Logrank,P=0.006ALK–positiveALK–negativeJ.X.Zhou，etal.AnnalsofOncology00:1–7,2012doi:10.1093/annonc/mds626多重RT-PCR测序EML4-ALK变异体的多种引物，GAPDH作为对照GLCI内部数据：所有12个ALK融合阳性样品均通过多路RT-PCR测序技术得以证实。国家药品食品管理局（SFDA）已批准的可用于临床的ALK融合基因检测的试剂盒（人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒，荧光PCR方法）VentanaIHC试剂设计ALK融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表达较低VentanaIHC的原理:使用具有高度敏感性和特异性的一抗——D5F3全自动仪操作，充分保证特异性独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性D5F3rabbittmonoclonalantibodyOptiviewDABIHCDetectionOptiviewAmplificationKitFISH阳性标本使用IHC检测全自动VentanaIHC：信号扩增常规IHC：无信号扩增D5F3rabbitmAbControlrabbitmAbALK-positiveNSCLCbyVysisFISHandVentanaALKIHCALK(+)病例全自动VentanaIHC判读标准简单，仅存在阴性or阳性的判读IHC阳性=FISH阳性ECMinca,etal.JMolDiag,2013全自动VentanaIHC价格便宜，可同时用于ALK的筛选和诊断EMEA（欧盟）批准VentanaIHC用于诊断ALK阳性NSCLC，从而帮助确定可使用克唑替尼的患者中国患者检测价格预估<250元/例ALK阳性NSCLC诊断方法专家推荐ALKFISH、VentanaIHC或基于序列特异性的PCR技术均可作为ALK阳性肺癌的诊断技术，检测实验室应该根据组织标本类型选择合适的检测技术。当怀疑一种技术的可靠性时（如FISH的肿瘤细胞融合率接近15％时），可以考虑采用另一种技术加以验证。日本肺癌协会ALK诊断共识YoshikoMurakami,etal.FrontiersinOncology.2012;doi:10.3389/fonc.2012.00024欧洲11家中心病理科ALK诊断共识ThunnissenE,etal.VirchowsArch.2012;461:245–257中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK检测流程图总体原则：可考虑非排他性地优先检测部分潜在ALK阳性率较高的病理学特征富集的肺癌患者（如粘液型或含印戒细胞腺癌患者、EGFR基因状态为野生型的腺癌）对于适合检测的肿瘤标本可选择直接采用FISH或RT-PCR方法或VentanaIHC进行分子检测诊断对于EGFR基因状态未知，或EGFR突变患者在EGFR-TKIs治疗后原发或继发耐药的患者，由于存在EGFR和ALK双阳性的可能，因此也建议行ALK融合的检测中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识ALK检测流程图总体原则：可考虑非排他性地优先检测部分潜