胰岛素生产流程图

胰岛素(E.Coli)生产流程2021/3/29星期一1

2021/3/29星期一2人胰岛素—碳水化合物代谢和体细胞供能一级结构：51个氨基酸双链（A：21，B：30）分子量：5734g/mol等电点：5.4胰岛素产生受损导致糖尿病2021/3/29星期一3人胰岛素的制备方法人胰腺提取---原料来源有限通过单个氨基酸化学合成---生产成本太高猪胰岛素转化或“半合成”--成本高，来源少基因工程菌发酵--双链—Genentech,开发，EliLilly放大--胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体）--分泌法（Yeast），NovoNordisk产业化

--细胞内法（E.coli），表达121+82个氨基酸的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵体，EliLilly产业化2021/3/29星期一4E.Coli胰岛素原法

转化流程2021/3/29星期一5市场分析和设计基础（2005）

糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增长率3-4%胰岛素年销售额35-40亿美元,由NovoNordisc、EliLilly和SanofiAventis三家垄断每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素目前年产量20-30吨纯胰岛素设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次每批次发酵液体积：37.5立方米，发酵罐空罐体积：50立方米2021/3/29星期一6人重组胰岛素（E.coli）生产流程发酵工段初回收工段反应工段终纯化工段2021/3/29星期一72021/3/29星期一8通气量：0.5VVM空罐体积：50立方米前接2级种子罐发酵周期：18小时发酵温度：37度终菌密度：30克（干重）/升包涵体含量：干重的20%终保温：10度发酵工段2021/3/29星期一9初回收工段—物料温度保持10度--三个平行的碟片式离心机收获菌体--菌液从37000L浓缩到9165L菌泥--菌体收率98%加与菌泥等体积的缓冲液(96.4%w/wWFI注射用水,0.7%EDTA,和2.9%TRIS-base)稀释,有利于菌体碎片与包涵体分离三次高压匀浆机破菌释放包涵体压降800bar终物料体积：1400L用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98%加2倍体积的清洗剂(0.66%Triton-X100),洗涤包涵体2021/3/29星期一10反应工段—溶解包涵体玻璃反应釜内加终浓度为300g/L(5M)的尿素（溶解变性蛋白）和40g/L的2-巯基乙醇（减少二硫键的结合）反应时间：8小时溶解收率：95%包涵体内Trp-LE’-Met-proinsulin含量

：80%w/wWFI透析6小时，收率98%，去除尿素和2-巯基乙醇过滤去除细小颗粒，保护后续层析柱。终体积5200L再次离心，去除菌体碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片离心机2021/3/29星期一11反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin70%甲酸溶液30倍过量加入CNBr(理论摩尔比1:1)收率95%反应时间：12小时反应温度：20度利用前面溶解反应釜在CNBr沸点35度旋转真空蒸发1小时会产生少量有毒氰化物气体，现场应准备次氯酸盐亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键，给半胱氨酸加上SO3部分pH9-11，50%w/w(6M)盐酸胍，0.35%碳酸氢铵，3%硫酸钠，1.5%过硫酸钠，反应时间12小时，收率95%WFI透析至盐酸胍浓度为20%w/w共用前面包涵体溶解过程的透析器2021/3/29星期一12反应工段—再折叠三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin床直径：140cm床高度：25cm填料：SPSepharoseFF,GE洗脱液：29%w/w尿素，1.5%NaCl,69.5%WFIpH4收率90%再折叠的目的是去除SO3，然后使二硫键形成，并再折叠成胰岛素原的正确天然结构加入巯基