生物化学检验实验室基本知识3省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

第三章生物化学检验试验室基本知识

11/89本章内容概要：第一节试验用纯水第二节试验用玻璃仪器第三节试验方法选择第四节试验方法评价第五节试验诊疗性能评价22/89教学目标和要求：1、掌握试验用纯水三级标准；试验方法分级、标准品分级及相互之间联络；试验误差定义、分类和表示方法；方法评价试验尤其是回收试验和干扰试验原理和操作；诊疗性能评价指标。2、熟悉纯水制备方法；试验方法选择标准和步骤；方法评价基本内容和步骤；方法评价指标；参考值和医学决定水平概念。3、了解水纯度检验；方法性能判断指标；受试者工作曲线应用和用途。33/89第一节试验用纯水天然水自来水试验用纯水经简单物理、化学方法处理，除去悬浮物质和部分无机盐经蒸馏、电渗析等处理，除去杂质(悬浮物,胶体物质,溶解物质)44/89一、纯水制备方法蒸馏法:优点:设备简单缺点:1、挥发性物质难以去除；2、耗能大，耗能水多；3、需注意管道清洁

纯度：25℃时1×105Ω·cm怎样安装：55/89离子交换法：氢型强酸性阳离子交换树脂

(R—SO3H，R为母体)

，其中H+与Ca2+、Na+等金属离子发生交换反应，而将钙、镁离子除去

氢氧型强碱性阴离子交换树脂(R′—NOH，R′为母体)，其中OH-与水中CL-、碳酸根等阴离子发生交换反应，而将它们除去：

66/89优点:除了可去除杂质离子以外兼具吸附电中性杂质和过滤颗粒杂质作用。缺点:

纯度：25℃时5×106Ω·cm2、因为离于交换为可逆反应，故去离子水并非绝对不含离子

1、设备较复杂，成本较高；77/89电渗透法

在电场作用下水中各种阳离子趋向阴极，各种阴离子趋向阳极．但阳离子只能透过阳膜而被相邻阴膜所阻，阴离子与此相反．这么，在一些隔间内集中了阳离子和阴离子，即形成含盐多浓水，在另一些隔间内因为阴、阳离子迁出降低了含盐量形成淡水

88/891、不需要消耗化学药品，设备简单，操作方便。消耗电能，当原水中盐浓度过低时，溶液电阻大，用电渗析也不经济

纯度:25℃时104～105Ω·cm2、对于含盐量高海水等用此法比用离子交换法更为经济．优点:缺点:99/89炭吸附法:活性炭是一个非常优良吸附剂，它是利用木炭、各种果壳和优质煤等作为原料，经过物理和化学方法对原料进行破碎、过筛、催化剂活化、漂洗、烘干和筛选等一系列工序加工制造而成。1010/891、设备简单，操作方便。纯水制备效率低.,仅作为各种制备纯水配套一个办法.

2、它含有物理吸附和化学吸附双重特征,能够有选择吸附气相、液相中各种有机物质.优点:缺点:1111/89超滤膜法特点:仅能除去胶体细菌等大分子物质和悬浮物,所得水还需深入纯化.也是作为各种制备纯水配套一个办法.1212/89混合纯化系统医用超纯水设备试验室纯水系统橱下式全自动逆渗透纯水机特点:各种方法混合纯化,可取得纯度很高二级甚至一级纯水.1313/89二、水纯度检验

用电导仪或兆欧表测定其电导率或电阻率用特定试剂检测水中残留Ca2+、Mg2+、CI-、SO42-

、硅酸盐等成份含量微生物含量检测单位：电导：西门子（s）电导率：s·cm-1电阻：Ω电阻率：Ω·cm1414/89CAP:美国病理学家学会试验用纯水标准1515/89NCCLS:美国临床试验室标准化委员会1616/89Ⅱ级水:临床试验室用水,普通试验检验;Ⅰ级水:特殊试验如酶活性测定、电解质分析等;Ⅲ级水:用做仪器、器皿自来水清洁后冲洗.试验用纯水用途1717/89试验用纯水贮存、运输和使用:普通选取聚乙烯或聚丙烯桶（瓶）贮存，贮存时间不宜太长，使用时应防止一切可能污染，切勿用手接触纯水或容器内壁.盛装药品,试剂1818/89第二节试验用玻璃仪器(了解)

1919/89第三节试验方法选择

选择准确可靠试验方法为临床提供准确可靠信息临床生化检验分析试验方法选择目标试验方法分级标准试剂分级确保2020/89一、试验方法选择目标根本目标：①各试验室按照方法选择标准结合本身条件，确定适当某项目标检测方法。②确保拟使用检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法性能及可能引入误差进行了解，作出初步评定。2121/89二、试验方法分级分级依据：IFCC依据分析方法准确性与精密度不一样。决定性方法参考方法常规方法分为三级：2222/89（一）决定性方法definitivemethod定义：

是指准确度最高，系统误差最小，经过详细研究，没有发觉产生误差原因或在一些方面不够明确方法，其测定结果与真值最为靠近。主要方法：重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）2323/89应用：

因为技术要求太高，费用昂贵，这类方法不直接用于判定常规方法准确性，只用于评价参考方法与一级标准品。储氢重量分析仪(北京英格海德分析技术有限企业)

2424/89（二）参考方法referencemethod定义：

是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布方法。这类方法干扰原因少，系统误差很小，有适当灵敏度、特异度、较宽分析范围而且线性良好，重复测定中随机误差能够忽略不计。主要方法：

原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等2525/89应用：

能在条件优越试验室作常规分析，主要用于判定常规方法，评价其误差大小、干扰原因并决定是否能够被接收；用于判定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒质量评价。2626/89（三）常规方法（routinemethod）定义：

应含有足够精密度、准确度和特异度，有适当分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目标需要。主要方法：

溴甲酚绿法、双缩脲法、J-G法等。应用：

临床常规检验使用，常规方法在作出评定以后，经相关学术组织认可，能够作为推荐方法（recommendedmethod

）

。偏差已知方法偏离未知方法2727/89项目决定性方法参考方法钙ID-MS原子吸收分光光度法氯电量滴定法、中子活化法电流滴定法镁ID-MS原子吸收分光光度法磷ID-MS钾ID-MS、中子活化法火焰光度法钠重量分析法、中子活化法火焰光度法白蛋白免疫化学法总蛋白双缩脲法肌酐ID-MS、离子交换层析法离子交换层析法尿素ID-MS尿素酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外法）胆红素——重氮反应法葡萄糖ID-MS己糖激酶法胆固醇ID-MSAbell-Kendall法，胆固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS酶法AST（GOT）

——MDH-NADH法ALT（GPT）——LDH-NADH法转肽酶（r-GT）——连续监测产物生成法肌酸激酶

——NAD+偶联法2828/89三、标准试剂分级标准试剂（标准品）定义：

国际标准化委员会将标准品（参考物，referencematerial）定义暂定为：它一个或几个物理或化学性质已经充分确定；被用于校正仪器或用于评价一个测定方法物质，并将其分成三级。标准品应用：方法评价、仪器校正、常规分析质量控制2929/89标准品分级：一级标准品二级标准品控制物3030/89（一）一级标准品（原级参考物）定义：

是已经确定稳定而均一物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确若干方法确定，所含杂质已经定量。应用：

用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。3131/89（二）二级标准品（次级参考物）定义：

这类标准品能够是纯溶液（水或有机溶剂溶液），也能够存在于相似基质中。可由试验室自己配制或为商品，其中相关物质量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。应用：

主要用于常规方法标化和控制物定值。3232/89（三）控制物（质控物）用二级标准品和常规方法测定，用于常规质量控制，以控制病人标本测定误差。控制物不能用于标定仪器或方法。

定值血清：在发生问题时查找原因

未定值血清：普通情况下使用另：用二级标准品和常规方法测定，然后定值经过修正后得到校准品。3333/89决定性方法一级标准品参考方法二级标准品常规方法控制物3434/89四、试验方法选择标准总标准：

从实际出发，依据试验室条件和检测要求确定适当方法。条件优越试验室：参考方法普通临床化学试验室试验室：常规方法或使用方便参考方法3535/89

尽可能选取国内外通用方法或推荐方法，便于方法规范化和质量控制，重点考虑实用性和可靠性。常规方法选择时标准：3636/89（一）实用性微量快速、方法简便、安全可靠、成本低廉（二）可靠性

所选方法含有较高精密度、准确度和较大检测能力，确保测定结果准确性能满足方法允许误差程度要求。标本μl、试剂ml3737/89五、试验方法选择步骤（一）广泛查阅文件：（二）选定侯选方法：全方面认识该法。（三）侯选方法初步试验：依据方法选择要求，比较各种方法3838/89初步试验包含：简单

标准曲线和重复性质控血清和新鲜标本重复试验析浓度不一样标本，并与公认参考方法结果对比.初步试验目标:

使工作者熟悉相关技术,掌握各分析步骤关键点,判断能否适合本室条件要求.依据所取得资料确定是否有必要作深入研究。初步试验3939/89第四节试验方法评价

初步试验判断符合试验要求系统评价决定该方法是否可接收分析评价试验测得结果和比较方法性能判断标准试验方法系统评价过程:对试验误差测定4040/89一、试验误差定义:指量值给出值与其客观真值之差.(一)试验误差分类:依据起源性质试验误差系统误差SE随机误差RE恒定系统误差CE百分比系统误差PE广泛性不可求另：粗大误差4141/89系统误差（systematicerror，SE）

定义:指一系列测定值对真值存在同一倾向偏差。特点:①含有单向性，而没有随机性，常有一定大小和方向；

②普通由恒定原因引发，并在一定条件下屡次测定中重复出现；③当找到引发误差原因，采取一定办法即可纠正，消除系统误差能提升测定准确度。4242/89分类:

CE：指由干扰物引发使测定值与真值存在恒定大小误差，误差大小与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关。

PE：指相对于被测物浓度有相同百分比误差，误差绝对量与被测物浓度成正比。

引发误差原因：

①方法误差：最严重，最难防止；②仪器和试剂误差：能够采取办法防止。4343/89随机误差（randomerror，RE）

特点:①误差没有一定大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；

②含有不可预测性，不可避兔，但可控制在一定范围内；

③当分析步骤越多，造成种误差机会越多；

④随测定次数增加，其算术均数就越靠近于真值。定义:指在实际工作中，屡次重复测定某一物质时引发误差。4444/89

由测定仪器、试剂、环境等试验条件改变以及分析人员操作习惯等原因改变而引发。系统误差随机误差引发误差原因引发误差原因：4545/89(二)试验误差表示方法：平均误差：算术平均偏差，用dm表示标准偏差（标准差）：表示精密度很好指标。绝对误差和绝对偏差：dm=Σ｜di｜/n=Σ｜X-｜/nΣdi2=N-1绝对误差=X-T绝对偏差=X-X4646/89相对误差和相对偏差：变异系数（coefficientofvariation，CV）相对误差=X-TT×100%相对偏差=X-XX×100%CV=SX×100比较各组数据间变异情况CV离散度精密度4747/894848/89二、方法评价基本内容和步骤(一)方法评价基本内容基本内容:经过试验路径，测定并评价方法精密度和准确度。评价试验过程:就是对误差测定。精密度和准确度误差方法评价指标不可直接测定

实际测定可直接测定方法评价试验4949/89(二)方法评价步骤评价前试验:研究候选方法最适条件。

初步评价:批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验

最终评价:依次序作日间重复性试验，方法比较试验和总体判断方法是否可接收

。评价后试验:如方法可接收，则进行临床相关研究.方法应用:建立质控系统，培训操作者，引人常规工作等。

随机误差系统误差方法性能判断诊疗学评价5050/89三、方法评价指标

精密度、准确度、特异度和干扰以及检测能力等（一）精密度（Precision）定义:表示测定结果中随机误差大小程度指标。它表示同一标本在一定条件下屡次重复测定所得到一系列单次测定值符合程度。表示方法:本身无量度指标，惯用标准差（S）或变异系数（CV％）表示。（n，X）（n，X）5151/89分类：连续测定精密度重复性精密度（了解）再现性精密度（了解）5252/89连续测定精密度：在相同条件下，对同一标本连续进行n次重复测定结果符合程度。在有限次测定情况下，普通用（总体标准差）预计值S（样本标准差）来表示这种精密度。定义：5353/89重复性精密度：

又称室（批）内精密度，指在相同条件下（一样方法、同一个试剂和标准品、一样仪器、在同一试验室由同一人操作，并要保持试验期间准确性不变）对同一标本在尽可能短时间内进行m轮n次重复测定结果之间相互靠近程度。重复性（批内）精密度（Sω）ΣSi2mSω=Si=Σ(xt-xt)2n-1CV=SωX×100定义：5454/89再现性精密度定义：又称室（批）间精密度，指在不一样条件下（不一样操作者，用不一样仪器，在不一样试验室和不一样时间）采取同一方法对同一标本所取得单次测定结果之间彼此符合程度。应用：多用于试验室间质量预计，其标准差常称为室间标准差。室（批）间标准差，是在对室（批）间重复性试验结果进行单原因完全随机设计方差分析后进行计算。5555/89（二）准确度：定义:

指测定结果与真值靠近程度，普通用偏差和偏差系数表示。表示方法:

偏差为重复测定均值（X）与真值之差。

偏差系数（CB）=×100

。｜真值-X｜真值定量标准品确认标准方法或5656/89影响原因：

系统误差、随机误差（了解）Σ表示已定系统误差综合。A=Σ+Δα（不确定度）

不确定度（uncertainty）是表示测定结果一个组成部分，它表明被测标本中真值存在范围5757/89（三）特异度和干扰即专一性，是指在特定试验条件下分析试剂只对待测物质起反应，而不与其它结构相同非被测物质发生反应。分析方法特异度越高，则测定结果越准确。特异度（specificity）是指标本中一些非被测物质本身不与分析试剂反应但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低，这些非被测物质称为干扰物。干扰（interference）特异度干扰方法准确性侧面指标正面指标5858/89（四）检测能力

定义：即检测程度或检出限（detectionlimit），是指能与适当“空白”读数相区分待测物最小值。空白读数：指由基质、试剂所得读数和结果，以及由仪器或测定过程所产生影响测定步骤残余偏差。试剂空白：试剂+D.W检出限TTTB5959/89四、评价试验

评价试验包含重复性试验回收试验于扰试验方法比较试验

6060/89（一）重复性试验试验目标:

试验方法:

对同一材料（标准液、质控液、标本等）分成数份试验标本进行屡次分析测定，并计算其均数、标准差与变异系数。检测候选方法随机误差（1）批内:标准液（2）日内:（3）日间:质控液（4）平行双份:试验形式:应注意问题:（1）分析标本选择（2）被测物浓度6161/89(二)回收试验试验目标:

试验方法:

将被测物标准液加人病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加人等量无被测物溶剂作基础标本；然后用候选方法测定并得到各自浓度。检测候选方法百分比系统误差。回收:

指候选方法准确测定加入常规分析标本纯分析物能力。6262/89回收浓度=分析标本测得浓度-基础标本测得浓度（实际测得值）计算:加入浓度=标准液量病人样品量（ml）＋标准液量（ml）

×标准液浓度（理论真实值）回收率（%）=回收浓度加入浓度

×100（理想值为１００％）百分比系统误差＝１－回收率＝＝真实值－测定值

真实值误差值

真实值6363/89注意事项：吸量准确；加入标准液后，其试验样品被子测浓度最好到达医学决定水平；总浓度必须在方法分析范围内；需加入高中低不一样浓度回收试验，计算平均回收率；加入标准液体积普通在10%内；重复2-3次。6464/89(三)干扰试验试验目标:

用来检测候选方法恒定系统误差。干扰物浓度不一样，误差大小也不一样干扰:指标本中一些非被测物质本身不与分析试剂反应但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低。6565/89试验方法:

基本与回收试验一样，但在病人标本中加人是疑有干扰或非特异性反应物质。将可能引发干扰物质配成一定浓度溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加人相同量无干扰物质溶剂作为基础样本；然后用候选方法对此两种样本同时测定，二者之差即表示该干扰物质产生干扰所引发误差，即干扰值干扰值=分析标本测得浓度-基础标本测得浓度计算:6666/89注意事项被试验物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、药品等可疑干扰物浓度：干扰物浓度有可能到达病理标本最高浓度值。本试验检测误差包含方法特异度不高和干扰物作用引发误差。消除干扰惯用方法空白对照：试剂空白：常见标本空白：内空白法和外空白法物理、化学方法分离干扰物双波长或多波长法检测排除干扰误差较大又无法消除，则改进或更换方法。（分析标本就是模拟实际标本）6767/89(四)方法比较试验（对比试验）（熟悉）试验目标:

试验方法:

对一组病人标本用候选方法和比较方法同时进行分析测定，观察二者之间差异。这是考验候选方法是否可采取主要办法。

用于检测候选方法系统分析误差。对所得数据进行分析，可提供系统误差性质（恒定或／和百分比误差）6868/89①在进行临床化学常规方法评价时，最好选择参考方法作为比较方法②若采取已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差一致那部分误差），剩下则属于侯选方法。③若采取未知偏差法，分析误差可能起源于二者之一或二者都有，难以分析。比较方法选择：应注意问题:统计处理：配对t检验、相关和回归分析。6969/89方法学评价试验小结重复性试验：测定候选方法偶然误差，衡量精密度。回收试验：测定百分比系统误差，衡量准确度。干扰试验：测定恒定系统误差，衡量准确度。方法对比试验：检测候选方法系统分析误差。7070/89五、方法性能判断方法选择方法评价试验诊疗性能评价方法性能判断建立质控,引入常规检验试验误差某一确定允许误差某一确定允许误差方法性能标准(PS):利用统计方法制订出一系列医学决定水平上９５％标本允许误差程度7171/89（一）方法学性能指标：１、允许分析误差：依据Westgard制订９５％标本允许误差程度，或者９５％病人标本其误差应小于这个程度，用ＥＡ表示。ＥＡ是大量研究,利用统计学方法制订出。２、医学决定水平：对临床病人诊疗含有医学判断作用临界分析物浓度，用Ｘc表示。Ｘc代表一个阈值。每个检测指标有一个或多个阈值。性能指标:ＥＡ和Ｘc组成某方法性能指标。即某方法在一定XC下ＥＡ值。7272/89

制订性能标准，要反应临床应用与解释结果要求（医学效用程度），又要基本符合试验室所能做到技能状态。方法学性能标准制订标准7373/89（二）方法性能判断指标：判断标准：各种误差值＜确定允许误差值ＥＡ

：

方法能够接收任何一项各种误差值＞

确定允许误差值ＥＡ：

方法不能接收性能判断指标：两套（了解）第一套：单值判断指标：简单，用于初步估量第二套：可信区间判断指标：复杂，对方法性能评价更客观，用于最终判断7474/89１、单值判断指标

误差类别判断指标备注随机误差（RE）1.96STM<EA

STM=重复试验标准差

百分比误差（PE）(|R-100|)(XC/100)<EAR=平均回收率恒定误差(CE)

|偏差|<EA

由干扰试验测出系统误差(SE)

|(a+bXc)-Xc|<EA

对比试验回归方程总误差(TE)

RE+SE<EA

包含偶然及系统误差7575/89（１）９０％可信区间、９５％可信上限和可信下限：

统计学规律说明，每种测定结果可靠性与测定次数相关，次数愈多，结果反应真实性愈强；但实际上，不可能进行大量测定。在统计学中为了估量分析误差不确定性，对于每一误差可计算其可信区间，用可信上限与可信下限代替单值估量，Ｅu为误差可信上限，Ｅl为误差可信下限。west-gard推荐用90％可信区间，这么，Ｅu将是误差单侧95％上限，用此判断候选方法可接收性比较可靠。7676/89假如，Ｅu

＜EA

，则方法性能为可接收；假如Ｅl

＞EA，则方法必须改进，以降低误差，不然排除。假如Ｅu

＞EA

，但Ｅl

＜EA

，说明仅有数据不足以作出任何相关可接收性结论，还需继续试验以搜集更多数据，方便对分析误差作出很好估量

7777/89２、可信区间判断指标计算公式：

误差类别试验接收指标EU<EA

排除指标EL>EA随机误差重复性1.96STMU<EA1.96STML>EA百分比误差回收|RU或L-100|U(XC/100)<EA|RU或L-100|L(XC/100)>EA*恒定误差干扰|d|+t(sd)/√NU<EA|d|+t(sd)/√NL>EA**系统误差对比|(a+bXc±W)-XC|U<EA|(a+bXc±W)-XC|L>EA***总误差重复性和√(1.96STMU)2+W2√(1.96STML)2+W2

方法对比+|a+bXc)-XC|<EA+|a+

bXc)-XC|>EA#*特例:当RU>100>RL,PEL=0**特例:当t(sd)/√NL>/偏差/,CEL=0***特例:当(a+bXc+W)>XC>(a+bXc-W),CEL=0#

特例:当SEL=0,TEL=REL

7878/89内容原理、试剂配制、所用器材、操作步骤等结论可接收或不被接收后期工作评价后试验和应用阶段。（三）评价试验书面汇报7979/89第五节试验诊疗性能评价

方法选择方法评价试验诊疗性能评价方法性能判断建立质控,引入常规检验方法学评价诊疗学评价临床诊疗试验室8080/89诊疗性能评价：

与临床诊疗相结合，建立参考值，采取临床评价标——诊疗灵敏度、诊疗特异度、预测值、似然比等作深入评价。与检测方法灵敏度、特异度相区分8181/89一、参考值和医学决定水平（一）参考值和参考范围正常值和正常值范围参考值和参考范围某地域选定一群健康人采取标准方法测定某项目，采取统计学方法处理求出和Ｓ为正常值±2S为正常值范围

参考个体（预定标准个体）

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