分子发光荧光磷光和化学省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

分子发光—荧光、磷光和化学发光

molecularluminescenceanalysis

概论分子荧光和磷光光谱分析法化学发光分析法1/54教学要求掌握荧光产生、荧光效率及其影响原因；重点掌握溶液强度与溶液浓度关系及定量分析方法；搞清荧光分析仪器主要部件及与分子吸收仪器主要区分。了解磷光分析法及化学发光分析法。重点：荧光效率及影响原因；溶液强度与溶液浓度关系及定量分析方法；难点：荧光产生，影响荧光效率原因2/54概述一、分子发光类型荧光Fluorescence磷光Phosphorescence化学发光Chemiluminescence光致发光3/54特点：灵敏度高（1-100ppb)：有可达0.01ppb。比吸收光度法高2-3个数量级。WHY??选择性好方法简单快速，用样量少应用不太广泛。4/54分子荧光与磷光光谱分析法

molecularfluorescenceandphosphorescence荧光：16世纪：在矿物和植物提取液中发觉荧光；1575年：Monardes——植物愈创木切片黄色水溶液——天兰色荧光；1852年：Stokes说明荧光发射机制（分光计观察奎宁和叶绿素荧光，发觉波长稍长于入射光波长——认识到荧光为“重新发光”而不是漫射光；1905年：Wood发觉气体分子共振荧光；1926年:Gaviola直接测定了荧光寿命；1923年：荧光X射线光谱；1964年：原子荧光光谱分析建立；1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；5/54磷光：15世纪被发觉（重晶石在强烈阳光下发光）1944年：Lewis提出磷光用于分析可能性；1957年：Keirs将磷光分析用于定量分析及多组份混合物分析；1963年：广泛用于血液及尿液中痕量药品及农药残留量分析；6/54一、荧光和磷光产生luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：各种路径和方式；速度最快、激发态寿命最短路径占优势7/542.电子激发态多重度电子激发态多重度：M=2S+1平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态（tripletstate

）能级比对应单重态（singletstate

）能级低；激发单重态：分子吸收能量，电子自旋依然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示

激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。大多数有机分子基态处于单重态，电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。

S0→T1禁阻跃迁8/54单重态基态S0吸收辐射通常自旋不变激发态S1/S2单重态基态S0吸收辐射自旋改变激发态T1/T2规则Hund平行自旋能量更低泡利不相容原理三重态tripletstate激发后S/T两态激发态9/54单重态与三重态

Mg基态与第一激发态基态1st激发态3s3p内量子数J有2S+1个取值(L+S),(L+S-1),…,(|L-S|)L=0(用S表示)1(用P表示)1J=012,1,0光谱

项

改变自旋/禁阻/磷光3p10/543.激发态→基态能量传递路径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，经过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量（去活化）传递路径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快路径，发生几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态最低振动能级→基态；11/54S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫12/54能量传递过程（1）振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或压力足够高气相中，处于激发态分子因碰撞将能量以热形式传递给周围分子，从而从高振动能层失活至低振动能层过程，称为振动弛豫。（2）内转换（InternalConversion，IC）对于含有相同多重度分子，若较高电子能级低振动能层与较低电子能级高振动能层相重合时，则电子可在重合能层之间经过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。（3）外转换（ExternalConversion，EC）受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失过程，也称“熄灭”或“猝灭”。13/54（4）系间跨跃（IntersystemConversion，ISC）系间跨跃是发生在两个不一样多重态之间无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻。然而，当不一样多重态两个电子能层有较大重合时，处于这两个能层上受激电子自旋方向发生改变，即可经过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。（5）荧光发射分子电子从单重激发态（Kasha规则）最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生光子辐射称为荧光。因为各种去活化过程存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。14/54（7）磷光发射从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最终，在10-4-10s内跃迁到基态各振动能层所产生辐射。在光照停顿后，磷光仍可连续一段时间。（8）延迟荧光通常，发生系间窜跃时，电子由S1较低振动能级转移至T1较高振动能级处。有时，经过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光机理。15/54去活化演示ee吸收驰豫eeS0S0S2S116/54去活化演示e内部转换e荧光e17/54荧光产生过程荧光产生eeee吸收激发振动驰豫内部转换S1最低振动能级荧光辐射S0各振动能级18/54二、荧光、磷光与化学结构关系1.荧光量子产率荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光能力，通惯用下式表示

或

在产生荧光过程中，包括到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间跨跃和外转移等。很显著，荧光量子产率，将与上述每一个过程速率常数相关。19/54kf:应光发射过程速率常数。

可见，凡是使kf增加，使其它去活化常数降低原因均可增加荧光量子产率。通常，kf由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。

分析应用价值：量子产率>0.1。

2.荧光、磷光与有机化合物结构关系

（1）跃迁类型：通常，含有—*及n—*跃迁结构分子才会产生荧光。而且—*跃迁量子效率比n—*跃迁要大得多（前者大、寿命短、kISC小）。20/542.荧光、磷光和有机化合物分子结构关系（1）.跃迁类型：通常，含有—*及n—*跃迁结构分子才会产生荧光。而且—*跃迁量子效率比n—*跃迁要大得多（前者大、寿命短、kISC小）。π→π*跃迁自旋许可跃迁，有利于荧光发射n→π*跃迁自旋禁阻跃迁，有利于磷光发射21/54（2）.共轭体系：共轭度越大，分子荧光效率越大，且荧光光谱向长波方向移动。增大共轭萘φf=0.29，λf=310nm蒽φf=0.46，λf=400nm在多烯结构中，ph（CH=CH）3ph和ph（CH=CH）2ph在苯中荧光效率分别为0.68和0.28。绝大多数能发荧光物质为含芳香环或杂环化合物。22/54（3）.平面刚性结构：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活机率下降，荧光量子效率提升。23/54（4）.取代基

给电子取代基增强荧光（p-共轭），荧光波长红移，如-OH、-OR、-NH2、-CN、NR2等；吸电子基降低荧光，而使磷光加强，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐步减弱到消失，该现象也称重原子效应。有利原因增大共轭刚性结构给电子基团不含杂原子24/543.无机化合物荧光（1）螯合物中配位体发光不少有机化合物即使含有共轭双键，但因为不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，伴随分子刚性增强，平面结构增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱荧光，但其金属螯合物含有很强荧光。（2）螯合物中金属离子特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先经过配位体

跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，造成dd

跃迁和f

f

跃迁，最终发射是d

d跃迁和f

f跃迁光谱。25/54三、影响光致发光原因1.荧光强度与溶液浓度关系泰勒级数展开常A<0.05If与A关系A与c正比，低浓度26/54（1）溶剂对荧光强度影响：

溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变—*及

n—*跃迁能量），并使荧光峰发生移动。与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度，并使荧光峰发生移动。（2）温度：温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子内部能量转化作用。当激发分子接收额外热能时，有可能使激发能转换为基态振动能量，随即快速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换去活几率增加。所以体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。2.影响荧光强度原因27/54（3）pH值影响：带有酸性或碱性官能团大多数芳香族化合物荧光与溶液pH相关。不一样pH值，化合物所处状态不一样，不一样化合物或化合物分子与其离子在电子构型上有所不一样，所以，它们荧光强度和荧光光谱就有一定差异。对于金属离子与有机试剂形成发光螯合物，首先pH会影响螯合物形成，另首先还会影响螯合物组成，因而影响它们荧光性质。（4）荧光熄灭（猝灭）效应荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引发荧光强度降低现象称为荧光熄灭。能引发荧光强度降低物质称为熄灭剂（猝灭剂）。

28/54

碰撞猝灭及能量转移：主要/外部转换热效应

溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用造成荧光强度下降。与熄灭剂碰撞：M*+Q→M+Q+热激发熄灭剂：M*+Q→M+Q*

氧熄灭：顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态。尤其对无取代基芳香族化合物荧光影响较为显著。溶剂粘度大↓温度高↑

自熄灭/自吸收

自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞自吸：荧光曲线与吸收曲线重合时，被基态分子吸收低浓度！29/54四、荧光和磷光分析仪器（一）荧光光度计光源单色器1样品池单色器2检测器放大与统计垂直方向30/54与分光光度计主要差异①垂直测量方式,消除透射光影响②两个单色器，激发和发射，惯用光栅光源：惯用氙灯、高压汞灯和激光光源。要求：强度大、使用波长范围宽试样室：四面光石英池固体试样架四面光比色皿31/54（二）激发光谱和荧光、磷光光谱excitationspectrumandfluorescence（phosphorescence）spectrum1.荧光(磷光)激发光谱曲线λEx

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射荧光(磷光)强度与照射光波长关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线最高处，处于激发态分子最多，荧光强度最大色散系统：光栅

第一单色器选激发光波长

第二单色器选荧光波长检测器：光电倍增管。32/542.荧光光谱(或磷光光谱)λEm

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。因为存在各种形式无辐射跃迁，损失了部分能量，故最大发射波长都向长波方向移动，尤以磷光波长移动最多，且它强度也相对较弱。33/54注意：因为分子吸收了不一样能量光子能够由基态激发到几个不一样电子激发态，而含有几个吸收带。因为较高激发态经过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态速率较高，远大于由高能激发态直接发射光子速率，故在荧光发射时，不论用哪一个波长光辐射激发，电子都从第一电子激发态最低振动能层返回到基态各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。

34/54（三）磷光计与荧光仪一体化试样室:试样池放在液氮杜瓦瓶内固体表面磷光需特制试样室磷光镜:一个机械切光装置.转筒式和转盘式时间分辨技术,去荧光35/54

磷光仪中2种机械切光器光源散射光、快速衰减荧光磷光分离36/54五、荧光、磷光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为何？检测下限：0.1～0.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可依据特征吸收光谱；（3）试样量少

缺点：应用范围小。37/54（一）荧光分析法应用(1)无机化合物分析

与有机试剂配合物后测量；可测量约60各种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采取荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采取荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采取催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采取低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采取固体荧光法测定(2)有机化合物分析脂肪族分子结构较为简单，本身会产生荧光极少，只有与其它有机试剂作用后可产生荧光。芳香族化合物含有不饱和共轭体系，多能发生荧光。另外如胺类、甾族化合物、蛋白质、酶与辅酶、维生素等均可用荧光法进行分析。38/54（三）、磷光分析法应用

在分析对象上，与荧光法互补1.稠环芳烃分析

采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）2.农药、生物碱、植物生长激素分析

烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析检测限0.01g/cm-3

3.药品分析和临床分析39/54一、概述化学反应产生激发态分子,光发射。用于痕量元素、环境检测、生物医学分析。

与荧光法互补。§9-2化学发光Chemiluminescence

特点：①灵敏度高：鲁米诺体系测定Cr3+等检测限10-9g/L

②线性范围宽：5～6个数量级

③发射光强度测量无干扰：无背景光、散射光干扰④设备简单：无光源，无需单色器，测发光总量⑤快速缺点：可供发光用试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中发光）；机理研究少。

40/54二、化学发光分析基本原理principle（一）化学发光反应条件：

能快速释放出足够能量。化学反应必须提供足够激发能，激发能主要起源于反应焓。

要有有利化学反应历程，使化学反应能量最少能被一个物质所接收并生成激发态。

激发态能释放光子或能够转移它能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子形式回到基态。

41/54（二）化学发光反应

基于化学反应所提供足够能量，使其中一个反应产物分子电子被激发，形成激发态分子，当它们从激发态跃回基态时，发出一定波长光。A+B=C+D*D*→D+h

（1）能够发光化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光连续时间较长，反应连续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。42/54（三）化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t化学发光强度(单位时间发射光量子数)：dc/dt分析物参加反应速率；43/54（四）化学发光强度与化学发光分析依据在化学发光分析中，被分析物浓度相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：44/54三、化学发光反应类型（一）气相化学发光反应1.臭氧化学发光反应没食子酸+O3

→A*+O2罗丹明B+A*→罗丹明B*+B罗丹明B*→罗丹明B+h

2.氮氧化合物化学发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

发射光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；可间接测定NO2(还原为NO)和NH3(高温氧化为NO2)测量汽车尾气中NOx45/543.氧原子与SO2、NO、CO发光反应O3

→O2

+O（1000C石英管中进行）SO2+O+O→SO2*+O2

SO2

*→SO2*+h

最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-34.火焰化学发光在富氢火焰中，也存在着很强化学发光反应；（1）一氧化氮NO+H→HNO*HNO*→HNO+h

发射光谱范围：660～770nm；最大发射波长：690nm；在富氢火焰中：

NO2+2H→NO+H2O可用此法测定空气中NOx总量，还可与气相色谱联用，作为氮化合物检测器。46/54（2）挥发性硫化物

挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强化学发光（蓝色）：

SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*S2*→S2+h

发射光谱范围：350～460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度平方成正比。47/54（二）液相中化学发光反应

机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水反应过程：48/54（1）该发光反应速度慢，一些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+