酶工程微生物发酵产酶

酶工程微生物发酵产酶

第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成

遗传信息传递的中心法则转录传递给RNA，再由RNA

蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA

第2页,共63页，2024年2月25日，星期天（一）RNA的生物合成--转录(transcription)

定义以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。.第3页,共63页，2024年2月25日，星期天转录模板

启动子（promotor)

终止子(terminator)模板链（templatestrand）反意义链(antisensestrand)编码链(codingstrand)有意义链(sensestrand)DNA5´5´3´3´反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.第4页,共63页，2024年2月25日，星期天TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意义链反意义链RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’第5页,共63页，2024年2月25日，星期天RNA的转录过程(三步)1.起始2.延长3.终止

第6页,共63页，2024年2月25日，星期天

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（

2

）

起始因子第7页,共63页，2024年2月25日，星期天RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段5

3

RNA

启动子（promotor)

终止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

离开第8页,共63页，2024年2月25日，星期天RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链有义链模板链（反义链）延长部位第9页,共63页，2024年2月25日，星期天

定义以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)

第10页,共63页，2024年2月25日，星期天酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码与反密码的碱基配对第11页,共63页，2024年2月25日，星期天AUGACA5’蛋苏UGUGUU3’受位(A位)给位(P位)大亚基小亚基第12页,共63页，2024年2月25日，星期天

蛋白质的合成过程

（大肠杆菌）

氨基酸的活化肽链合成的起始肽链的延伸肽链合成的终止与释放第13页,共63页，2024年2月25日，星期天氨基酸的活化与转运反应式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi

对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第14页,共63页，2024年2月25日，星期天在核糖体上合成多肽（三阶段）1、起始阶段2、延伸阶段3、终止阶段第15页,共63页，2024年2月25日，星期天肽链合成的起始阶段1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物2.AUG与fMet-tRNA结合：

30S-mRNA-IF3

fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。3.大小亚基结合IF130S起始复合物第16页,共63页，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亚基mRNAfMet-tRNAGTP大亚基GDP+Pi受位给位fMetfMet肽链合成的起始阶段第17页,共63页，2024年2月25日，星期天肽链合成的延伸阶段1.进位:氨基酰-tRNA进入受位;2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。第18页,共63页，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’UACfMet苏UGUAUGACA5’UACfMet苏UGUGUUAUGACA5’UACfMet苏UGUGUUAUGACA5’fMet苏UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始复合体进位转肽移位Mg+K+第19页,共63页，2024年2月25日，星期天肽链合成的终止阶段1.出现终止密码并与终止因子结合;2.酯键水解,多肽释放;3.tRNA,mRNA,大小亚基解离.

第20页,共63页，2024年2月25日，星期天AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’终终AUGUAA5’UAC3’终5’3’UAC终肽链第21页,共63页，2024年2月25日，星期天二、酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。第22页,共63页，2024年2月25日，星期天

操纵子——基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质,structuralgene,S）控制部位操纵基因（operatorgene,O）启动子（promotorgene,P）（一）基因调控理论

JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）

第23页,共63页，2024年2月25日，星期天基因操纵子调节系统示意图

调节基因

启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白

蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子第24页,共63页，2024年2月25日，星期天

调节基因(regulatorgene)：

可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)

（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。第25页,共63页，2024年2月25日，星期天cAMP-CRP复合物的作用示意图

启动基因（promotorgene）（启动子）：有两个位点：

（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

第26页,共63页，2024年2月25日，星期天操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。第27页,共63页，2024年2月25日，星期天(二)酶合成调节的类型

1.诱导

(induction)

组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

2.阻遏

(repression)

分解代谢物阻遏(cataboliterepression)

反馈阻遏(feedbackrepression)第28页,共63页，2024年2月25日，星期天（三）酶合成的调节机制

1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。第29页,共63页，2024年2月25日，星期天调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖

阻遏蛋白（有活性）诱导第30页,共63页，2024年2月25日，星期天2.末端产物阻遏

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

酶合成阻遏的现象：

实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。第31页,共63页，2024年2月25日，星期天

色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达第32页,共63页，2024年2月25日，星期天3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。第33页,共63页，2024年2月25日，星期天分解代谢物阻遏现象：

实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。

这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。第34页,共63页，2024年2月25日，星期天分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态第35页,共63页，2024年2月25日，星期天三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）

1.诱变育种

(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型

2.基因工程育种

第36页,共63页，2024年2月25日，星期天（二）条件控制1.添加诱导物酶的底物类似物最有效。2.降低阻遏物浓度

除去终产物产物阻遏添加阻止产物形成的抑制剂避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富添加一定量的cAMP第37页,共63页，2024年2月25日，星期天3.添加表面活性剂

离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80

非离子型增加细胞通透性

TritonX－1004.添加产酶促进剂第38页,共63页，2024年2月25日，星期天

第二节酶发酵动力学

一、细胞生长的阶段

在分批培养(batchculture)过程中，细胞生长一般要经历调整期、生长期、平衡期和衰亡期4个阶段。第39页,共63页，2024年2月25日，星期天细胞生长曲线

O-A调整期

A-B生长期

B-D平衡期

D-E衰亡期

第40页,共63页，2024年2月25日，星期天

二、产酶动力学

（一）酶生物合成的模式

根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为4种模式，即：同步合成型生长偶联型——

中期合成型部分生长偶联型——延续合成型非生长偶联型——

滞后合成型第41页,共63页，2024年2月25日，星期天1.同步合成型

酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。第42页,共63页，2024年2月25日，星期天2.中期合成型—生长偶联型中的特殊形式酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。

枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线

第43页,共63页，2024年2月25日，星期天3.延续合成型（又称部分生长偶联型）

酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线第44页,共63页，2024年2月25日，星期天4.滞后合成型（又称非生长偶联型）

只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线

第45页,共63页，2024年2月25日，星期天总结：影响酶生物合成模式的主要因素高：可在细胞停止生长后继

1）mRNA的稳定性续合成酶差：随着细胞停止生长而终止酶的合成2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。第46页,共63页，2024年2月25日，星期天

酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。第47页,共63页，2024年2月25日，星期天(二)产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中X——细胞浓度(g/L)

——细胞比生长速率(h-1)

——生长偶联的比产酶系数(IU/g)

——非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh))E——酶浓度(IU/L)t——时间(h)第48页,共63页，2024年2月25日，星期天生长偶联型部分生长偶联型

非生长偶联型

第49页,共63页，2024年2月25日，星期天

一.微生物发酵产酶方法

1.固体培养:特别适合于霉菌培养

2.液体深层发酵:目前酶发酵生产的主要方式

3.固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器

第三节微生物发酵产酶第50页,共63页，2024年2月25日，星期天二.微生物酶的类型

1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。

2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。第51页,共63页，2024年2月25日，星期天三、产酶微生物的分离和选育

1.优良产酶菌种应具备的条件（1）酶产量高（2）易培养（生长速率高、营养要求低）（3）产酶性能稳定，不易退化（4）易分离提纯（5）安全可靠（不是致病菌）第52页,共63页，2024年2月25日，星期天2.常用的产酶微生物⑴细菌：大肠杆菌；枯草芽胞杆菌⑵放线菌：链霉菌⑶霉菌：黑曲霉；米曲霉；根霉；木霉，青霉⑷酵母：啤酒酵母；假丝酵母第53页,共63页，2024年2月25日，星期天3.产酶微生物的分离和筛选

1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品

2)富集培养:投其所好，取其所抗

3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）。

4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。

5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

第54页,共63页，2024年2月25日，星期天

-淀粉酶的筛选