高效液相色谱-

高效液相色谱-二、定义色谱法(Chromatography)：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。第2页,共108页，2024年2月25日，星期天色谱法的分离原理利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以及在两相间分配系数的差异,当两相相对移动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。两相中，固定不动的一相称固定相(Stationaryphase)；移动的一相称流动相(Mobilephase)，携带样品流过整个系统的流体。第3页,共108页，2024年2月25日，星期天色谱发展史◆100年前，俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paperchromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layerchromatography,TLC)。特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gaschromatography,GC)

特点：以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。◆20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）。第4页,共108页，2024年2月25日，星期天液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用第5页,共108页，2024年2月25日，星期天一、液-固吸附色谱（一）分离原理（二）常用吸附剂（三）吸附剂和流动相的选择经典液相色谱第6页,共108页，2024年2月25日，星期天（一）分离原理

各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心

利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质

1.硅胶

2.氧化铝

3.聚酰胺第7页,共108页，2024年2月25日，星期天1.硅胶结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心

特性：

1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱2）吸水→失活→105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力适用：分析酸性或中性物质

第8页,共108页，2024年2月25日，星期天2.氧化铝碱性氧化铝pH9～10适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH＞7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4～5适于分析酸性、中性物质3.聚酰胺氢键作用氢键能力↑强，组分越后出柱第9页,共108页，2024年2月25日，星期天（三）吸附剂和流动相的选择：

依据被测组分、吸附剂和流动相的性质1.被测组分性质（极性大小）：

烃＜

--------＜羧酸，醇2.吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强

强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂3.流动相的极性：流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大

“相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相第10页,共108页，2024年2月25日，星期天4.三者关系图示：组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性第11页,共108页，2024年2月25日，星期天二、薄层色谱法（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择（四）展开剂的选择（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析第12页,共108页，2024年2月25日，星期天（一）概述1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2．操作过程：铺板→活化

→点样

→

展开

→定位(定性)/洗脱(定量)3．分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）4．特点：分析快速、灵敏、显色方便5．应用：药物杂质检查、纯度测定第13页,共108页，2024年2月25日，星期天第14页,共108页，2024年2月25日，星期天L0L1L2第15页,共108页，2024年2月25日，星期天（二）定性参数1.比移值Rf讨论

Rf与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为第16页,共108页，2024年2月25日，星期天

1）K↑大，Rf↓小

2）薄层板一定，对于极性组分展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱）展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易洗脱）

3）Rf范围：0<Rf<1

（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）

Rf=0.2——0.8（常用）

0.3——0.5（最佳）第17页,共108页，2024年2月25日，星期天2.相对比移值Rs

参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可为样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1第18页,共108页，2024年2月25日，星期天（三）吸附剂的选择

根据被测物极性和吸附剂的吸附能力

被测物极性强——弱极性吸附剂

被测物极性弱——强极性吸附剂（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择）

根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性第19页,共108页，2024年2月25日，星期天（五）薄层板的制备硅胶G——自含粘和剂硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光（六）定性与定量分析定性分析——日光，紫外光，显色定量分析——洗脱法，薄层扫描法第20页,共108页，2024年2月25日，星期天三、纸色谱法将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：RfRf与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分→易保留，Rf小（流动相极性↑，Rf↑）非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf↓）第21页,共108页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱知识第22页,共108页，2024年2月25日，星期天

经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天~10min经典LC与HPLC比较HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便

HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器第23页,共108页，2024年2月25日，星期天GC与HPLC比较

GCHPLC流动相惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物不同极性的液体（有一定亲和作用）温度较高一般室温分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物第24页,共108页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱的固定相和流动相

（－）固定相

高效液相色谱固定相依据承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。

刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，是目前最广泛使用的一种固定相。

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

第25页,共108页，2024年2月25日，星期天1.表面多孔型固定相

基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。

特点：多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。

第26页,共108页，2024年2月25日，星期天2．全多孔型固定相

由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的LichrosorbALOXT。

特点：颗粒很细（5-10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析第27页,共108页，2024年2月25日，星期天

第28页,共108页，2024年2月25日，星期天（二）流动相

高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。第29页,共108页，2024年2月25日，星期天第30页,共108页，2024年2月25日，星期天（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第31页,共108页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱法分类及分离机理分配色谱—样品组分在吸附于惰性载体上的固定液和流动相之间分配系数不同键合相色谱—样品组分在键合于惰性载体上的固定液和流动相之间的分配系数不同吸附色谱—样品组分对固定相表面吸附力不同体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开离子交换色谱—不同离子与固定相上相反电荷间的作用力大小不同亲和色谱—利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法第32页,共108页，2024年2月25日，星期天（一）分配色谱（partitionchromatography）原理：固定液吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分配而实现分离。适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。第33页,共108页，2024年2月25日，星期天流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。

第34页,共108页，2024年2月25日，星期天反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水－甲醇体系：大约60％水的时候粘度最大水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。第35页,共108页，2024年2月25日，星期天(二)键合相色谱（Covalent－stationaryphasechromatography）为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。目前应用最广泛的一种固定相，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。键合固定相优点：对极性有机溶剂有良好的化学稳定性；使色谱柱的柱效高、寿命长；实验重现性好；几乎适于各种有机化合物的分离；可以梯度洗脱。缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。

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1．键合固定相类型

用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)反应成键,可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.第37页,共108页，2024年2月25日，星期天2．键合固定相的制备（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相制备反应如下

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共价键键合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4-8范围内。第39页,共108页，2024年2月25日，星期天（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相制备反应如下：

这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH=2-8范围内正常工作，应用较广泛。第40页,共108页，2024年2月25日，星期天3．反相键合相色谱法

反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。流动相：极性较强的溶剂，如甲醇一水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。适于分离非极性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的最主要分离模式。若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。

第41页,共108页，2024年2月25日，星期天4.正相键合相色谱法

正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。流动相：非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如醇）适合分离脂溶、水溶性的极性、强极性化合物。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。第42页,共108页，2024年2月25日，星期天5.离子性键合相色谱法

固定相：以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3)2等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相：一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。

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第44页,共108页，2024年2月25日，星期天（三）液一固吸附色谱法(LSAC)分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质，表面有吸附中心，样品组分与流动相竞争吸附中心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同而实现分离。当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子），在固定相表面发生竞争吸附:

X+nSad=Xad+nS第45页,共108页，2024年2月25日，星期天

达平衡时,有

其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。第46页,共108页，2024年2月25日，星期天固定相：通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。应用：对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。第47页,共108页，2024年2月25日，星期天极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：氟碳化合物<饱和烃<烯烃<芳烃<有机卤化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸第48页,共108页，2024年2月25日，星期天正相HPLC（normalphaseHPLC）：由极性固定相和非极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱，OctaDecyltrichloroSilane)，代表性的流动相是甲醇和乙腈。第49页,共108页，2024年2月25日，星期天（四）体积排阻色谱（SEC，sizeexclusionchromatography）排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。第50页,共108页，2024年2月25日，星期天原理：以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核酸、多糖。凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。

SEC主要依据分子量大小进行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关。不采用改变流动相的组成来改善分离度。第51页,共108页，2024年2月25日，星期天固定相

排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。

所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。

（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。

（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。

（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。第52页,共108页，2024年2月25日，星期天流动相

1）排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品。

2）与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。

3）溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。

4）选择溶剂还必须与检测器相匹配。

常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。第53页,共108页，2024年2月25日，星期天（五）离子交换色谱（ionexchangechromatography,IEC）利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第54页,共108页，2024年2月25日，星期天分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。第55页,共108页，2024年2月25日，星期天1．离子交换原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：

第56页,共108页，2024年2月25日，星期天达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：

式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般形式：

R一A＋B＝R－B＋A第57页,共108页，2024年2月25日，星期天

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铵型强阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－第58页,共108页，2024年2月25日，星期天2．固定相作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分，再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。第59页,共108页，2024年2月25日，星期天分类按离子交换剂类型：强阳离子交换剂以磺酸基为代表（-SO3-)强阴离子交换剂以季胺基为代表(-NR3+)弱阳离子交换剂以羧酸基为代表(-COO-)弱阴离子交换剂以二乙基氨基为代表(-CH2N(C2H5)2H+)第60页,共108页，2024年2月25日，星期天按固定相制作方法：多孔型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂表面多孔型离子交换树脂离子交换键合固定相第61页,共108页，2024年2月25日，星期天

（l）多孔型离子交换树脂主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5-20μm，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型离子交换树脂是在直径约30μm的固体惰性核上，凝聚1-2μm厚的树脂层。（3）表面多孔型离子交换树脂是在固体惰性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。（4）离子交换键合固定相是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。

第62页,共108页，2024年2月25日，星期天流动相

1）离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。

2）通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。

一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十差别不如阴离子明显。

3）关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

第63页,共108页，2024年2月25日，星期天(六)亲和色谱法（AC）1）亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。

2）通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。

3）固载化的配基只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。第64页,共108页，2024年2月25日，星期天固定相：载体和配基载体：具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、多孔玻璃配基：对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团，如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等流动相：缓冲溶液应用：生物大分子分离和分析第65页,共108页，2024年2月25日，星期天分离类型的选择

1．根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用排阻法为最佳。2．根据溶解度选择弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸第66页,共108页，2024年2月25日，星期天

附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。

3．根据分子结构选择用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物或不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。现列表作为选择分离类型的参考。第67页,共108页，2024年2月25日，星期天

液相色谱分离类型选择参考表溶于水——排阻色谱，水为流动相相对分子质量＞2000不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——分配色谱不溶于水异构体——吸附色谱样品分子大小差异——排阻色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解＜2000排阻色谱，水为流动相碱——阳离子交换色谱溶于水，可离解酸——阴离子交换色谱第68页,共108页，2024年2月25日，星期天HPLC仪器:HPLC仪器1.流动相系统4.其他辅助系统2.分离系统3.检测系统第69页,共108页，2024年2月25日，星期天Agilent1100系列高效液相色谱系统第70页,共108页，2024年2月25日，星期天储液槽第71页,共108页，2024年2月25日，星期天☆

贮液槽

贮液槽材料：应当耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（PEEK）。

贮液槽容积：0.5-2.0L。

要求：

1.贮液槽放置位置要高于泵体，以保持一定的输液静压。

2.贮液槽在使用中应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，并可防止空气中的CO2,O2重新溶解于脱气的流动相中。

第72页,共108页，2024年2月25日，星期天采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择第73页,共108页，2024年2月25日，星期天溶剂前处理

过滤：0.45um或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时脱气目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡第74页,共108页，2024年2月25日，星期天脱气装置氦气脱气法在线脱气法第75页,共108页，2024年2月25日，星期天☆脱气

①吹氦气脱气法适于给所有溶剂脱气，脱气效率高，但价格昂贵。(如上图：左图)

②加热回流法

③抽真空脱气法外接真空泵，对溶剂抽真空。由于抽真空会引起溶剂组成的改变，故不适于混合溶剂。因此要对每种溶剂预先脱气后再进行混合。

④超声波脱气法将溶剂倒入超声波清洗器中，用超声波震荡赶走气泡。脱气效果最差。

以上方法均为离线脱气，随溶剂存放时间延长又会有空气进入溶剂。

⑤在线真空脱气法将真空脱气装置串接到贮液罐于高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连续脱气。脱气效果最优(如上图:右图)。第76页,共108页，2024年2月25日，星期天高压输液泵恒流泵第77页,共108页，2024年2月25日，星期天☆高压输液泵

在高效液相色谱分析中，色谱柱装填5-10μm的固定相，对流动相的通过有很大的阻力。高压输液泵的作用就是用较高的压力推动流动相进入色谱柱。

高压输液泵分两类：恒流泵恒压泵

恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。

（1）单柱塞注射型泵

（2）双柱塞往复型并联泵恒压泵，是输出恒定压力的泵。

以压缩空气为驱动力，高压推动活塞往复运动完成流动相的吸入和输出。以改变气体压力调节载液流速。

第78页,共108页，2024年2月25日，星期天等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂第79页,共108页，2024年2月25日，星期天梯度洗脱

A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B

浓度第80页,共108页，2024年2月25日，星期天分析时间长分离度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脱第81页,共108页，2024年2月25日，星期天95%30%甲醇浓度梯度洗脱第82页,共108页，2024年2月25日，星期天混合器低压梯度比例阀高压梯度低压梯度脱气机高压/低压梯度系统第83页,共108页，2024年2月25日，星期天高压梯度系统梯度准确度好系统复杂(需两台或三台泵)低压梯度系统系统简单需在线脱气机存在时间滞后效应高压/低压梯度系统第84页,共108页，2024年2月25日，星期天Agilent四元梯度泵第85页,共108页，2024年2月25日，星期天进样器手动进样器自动进样器

第86页,共108页，2024年2月25日，星期天手动进样器的原理图

装填状态进样状态第87页,共108页，2024年2月25日，星期天部分注入和全量注入部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20μl的定量环最多进样10μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。第88页,共108页，2024年2月25日，星期天

手动进样器操作注意点：1）进样应使用液相色谱专用平头进样针2）进样时，进样针应插到底3）转动手柄时应尽快，不要停留在中途4）样品溶液pH小于10,常用密封垫的材质适用pH<10,否则换特氟隆材质的密封垫pH10-13第89页,共108页，2024年2月25日，星期天交叉污染微量注射器

红色表示残留样品第90页,共108页，2024年2月25日，星期天手动进样法便捷的方法（不需清洗）

1.进样状态下插入微量注射器

2.切到装填状态