色谱法分离原理

色谱法分离原理第18章色谱法分离原理第2页,共80页，2024年2月25日，星期天18.1概述

色谱法或层析法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。原理：利用物质在固定相和流动相中的分配系数不同，使混合物中的各组分分离。以前学过的分离方法有：

1.沉淀法是利用物质溶解度的不同而进行分离。

2.蒸馏法是利用有机物沸点的差异进行分离。

3.萃取法是利用组分在水相和有机相（互不相溶）中的分配素数不同进行而分离。第3页,共80页，2024年2月25日，星期天

一色谱分析法简介

色谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。

MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparatedplantpigmentsbyelutingamixtureofthepigme--ntsonacolumnofcalciumcarbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredba--nds;hencethenamechromatography.第4页,共80页，2024年2月25日，星期天植物色素分离图示第5页,共80页，2024年2月25日，星期天二色谱法分离原理分离原理:物质的分配系数差异。三色谱法分类色谱法可从不同的角度进行分类：1.按流动相与固定相的分子聚集状态分类在色谱法中流动相可以是气体、液体和超临界流体(gaschromatography,GC、liquidchromatography,LC、supercriticalfluidchromatography,SFC)。按固定相为固体(如吸附剂)或液体，气相色谱法又可分为GSC与GLC；液相色谱法又可分为LSC及LLC。第6页,共80页，2024年2月25日，星期天2.按操作形式分类柱色谱法(columnchromatography)是将固定相装柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行。按色谱柱的粗细等，又可分为填充柱(packedcolumn)色谱法、毛细管柱(capillarycolumn)色谱法及微填充柱(microborepackedcolumn)色谱法等类别。第7页,共80页，2024年2月25日，星期天3.按色谱过程的分离机制分类

可分为分配色谱法(partitionchromatography)、吸附色谱法(adsorptionchromatography)、离子交换色谱法(ionexchangechromatography，IEC)、空间排阻色谱法(stericexclusionchromatography，SEC)及亲合色谱法(affinitychromatography)等类型。第8页,共80页，2024年2月25日，星期天色谱法简单分类如下表:第9页,共80页，2024年2月25日，星期天18.2色谱法基础知识、基本概念和术语18.2.1色谱流出曲线:

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一基线

在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。使基线发生细小的波动的现象称为噪音。

基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。

第11页,共80页，2024年2月25日，星期天二峰高（h）

色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。可用mm,mV,mA表示。h第12页,共80页，2024年2月25日，星期天

宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。区域宽度通常有三种表示方法：标准偏差

：峰高0.607倍处峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4

三区域宽度第13页,共80页，2024年2月25日，星期天

四色谱峰面积A

色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。对于对称的色谱峰

A=1.065hW1/2

对于非对称的色谱峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2第14页,共80页，2024年2月25日，星期天

五保留值组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。(1)比移值

Rf=ux/u=nm/(nm+ns)(2)死时间(tM)

不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间。它与色谱柱的空隙体积成正比。第15页,共80页，2024年2月25日，星期天

(3)保留时间tR

试样从进样到出现峰极大值时的时间。

(4)调整保留时间某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即

第16页,共80页，2024年2月25日，星期天(5)死体积VM

色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：(6)保留体积VR

指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。其中，Fco为柱出口的载气流速（mL/min)

第17页,共80页，2024年2月25日，星期天

(7)调整保留体积某组份的保留体积扣除死体积后的体积。

tM﹑VM与被测组分无关，因而·

更合理地反映了物质在柱中的保留情况。

(8)相对保留值r2,1

组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。第18页,共80页，2024年2月25日，星期天

r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰i

对标准峰的相对保留值，此时以

表示：

>1,又称选择因子第19页,共80页，2024年2月25日，星期天

（9）保留指数规定正构烷烃保留指数为分子中碳原子个数乘以100，如正己烷、正庚烷的保留指数分别为600和700。被测物质的保留指数IX可采用两个相邻正构烷烃的保留指数进行测定将碳数为n和n+1的正构烷烃加到被测物质x中进行色谱分析，测得它们的保留值第20页,共80页，2024年2月25日，星期天保留指数计算方法利用上式求出未知物的保留指数与文献值对照n）tR(n+1)第21页,共80页，2024年2月25日，星期天

六分配系数和分配比在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。1分配系数(K)：它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即第22页,共80页，2024年2月25日，星期天

K与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。实验条件固定时，K主要取决于固定相性质。某组分的K=0时，表明组分不被保留—即惰性组分第23页,共80页，2024年2月25日，星期天

2.分配比：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。

k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值第24页,共80页，2024年2月25日，星期天

3.

K与k

的关系：

称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，

=6~35；对毛细管柱，

=60~600。

注意：K或k反映的是某一组分在两相间的分配；而

是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k

相同时，

=1

时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，

越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。

和k

是计算色谱柱分离效能的重要参数！第25页,共80页，2024年2月25日，星期天

例1:从色谱测得组分1流出时间为16min30s，组分2流出时间为26min，空气流出时间为1min30s，求：（1）

组分2对组分1的相对保留时间（2）

色谱柱对组分1的容量比（3）

组分2的分子在固定相中停留时间[解]：(1)

γ2,1=(tR2-tM)/(tR1-tM)=(26.0-1.5)/(16.5-1.5)=1.63(2)

k’=(tR1-tM)/tM=(16.5-1.5)/1.5=10.0(3)

t’R2=26.0-1.5=24.5min第26页,共80页，2024年2月25日，星期天色谱流出曲线的意义☆色谱峰数——样品中单组份的最少个数；☆色谱保留值——定性依据；☆色谱峰高或面积——定量依据；☆色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；☆色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据第27页,共80页，2024年2月25日，星期天18.3色谱法基本理论18.3.1塔板理论

在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法。第28页,共80页，2024年2月25日，星期天塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。第29页,共80页，2024年2月25日，星期天

(一）色谱分离过程：第30页,共80页，2024年2月25日，星期天第31页,共80页，2024年2月25日，星期天(二)色谱流出曲线方程第32页,共80页，2024年2月25日，星期天

(三)柱效对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每一个塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n表示。

n=L/H或H=L/n

H越小，n越多，分离效果越好，用H,n评价柱效。由塔板理论导出n与W，W1/2

的关系。

n=5.54(tR/W1/2)2

=16(tR/W)2

第33页,共80页，2024年2月25日，星期天

有时n大，分离效果也不好，因用tR内含tm，后来改用有效塔板数。n有效=5.54(tR′/

W1/2)2=16(tR′/W)2

H有效＝Ｌ／n有效n理

=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2

H理＝Ｌ／n理第34页,共80页，2024年2月25日，星期天(四)塔板理论的特点(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。第35页,共80页，2024年2月25日，星期天

塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性:塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第36页,共80页，2024年2月25日，星期天

前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的n和H也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。18.3.2

速率理论——范弟姆特方程式：

第37页,共80页，2024年2月25日，星期天18.3.2.1气相色谱的速率理论1涡流扩散项(σ12)

在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽。第38页,共80页，2024年2月25日，星期天

展宽程度以σ12表示：σ12=2dpL

其中dp—填充物平均直径；

—填充不规则因子。减小σ12

：固定相颗粒应适当细小、均匀填充要均匀。

对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即σ12=0。

第39页,共80页，2024年2月25日，星期天

待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓→稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。

（2）分子扩散项σ22

（纵向扩散项）

第40页,共80页，2024年2月25日，星期天

σ22

＝2γDL/u

γ——是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。

D——为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）。

Dg——气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）第41页,共80页，2024年2月25日，星期天

减小纵向扩散项σ22采取措施：

①适当提高流动相流速u，减小保留时间②用相对分子质量较大的气体作流动相。

③适当降低柱温Ｔc.第42页,共80页，2024年2月25日，星期天

σ32—流动相传质阻力系数组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。（3）流动相传质阻力项σ32和固定相传质阻力项σ42

采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体作载气,可减少σ32,提高柱效。第43页,共80页，2024年2月25日，星期天

σ42

­—固定项传质阻力系数即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。组分在固定相中扩散系数固定液的膜厚度第44页,共80页，2024年2月25日，星期天减小σ42采取措施：①降低固定液的含量,可以降低液膜厚度,但k随之变小,又会使σ42增大。②当固定液含量一定时,液膜厚度随载体比表面积增加而降低,因此,一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。③降低固定液液膜厚度(σ42∝df2)并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；但不能太薄，否则包不住载体。④提高柱温,虽然可以增大D1,但会使值减小,为了保持适当的值,应该控制适宜的柱温。

第45页,共80页，2024年2月25日，星期天

u为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—分别表示涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。在流动相流速一定时:Ａ、Ｂ、Ｃ最小时，Ｈ才小，n才最高，柱效高。Ａ、Ｂ、Ｃ最大时，Ｈ才大，n才最小，柱效低。第46页,共80页，2024年2月25日，星期天为提高柱效，Ｈ小，应注意以下几点：１）采用适当小而均匀的载体，柱填充应均匀。２）固定液液膜薄而均匀，并且不宜流失。３）载气流速小的时候，Ｂ／u是影响Ｈ的主要因素，选Ｍr大的载气，Ｎ２；载气流速大的时候，Cu是影响Ｈ的主要因素，选Ｍr小的载气，H2，Ne４）采用适当的柱温。

气相色谱

uDsk′k′dDdk′k′uDdHfgpgp])1(32)1(01.0[2222222+++++=gl第47页,共80页，2024年2月25日，星期天18.3.2.2液相色谱的速率理论速率理论虽然实在研究气液色谱时提出的,但作适当修改,也使用于液相色谱,其板高方程可写成如下形式:

式中Ce、Cm、Cd、Cs、Csm为有关项的板高系数,当填料一定时均为定值;DM和DS分别是组分在流动相和固定相的扩散系数;df为固定相层的厚度.

(Ⅰ)(Ⅱ)(Ⅲ)(Ⅳ)(Ⅴ)第48页,共80页，2024年2月25日，星期天★Ⅰ表示涡流扩散项.LC与GC相似,涡流扩散项和填料的粒径有关.

填料粒径越小,涡流扩散项越小,反之亦然★Ⅱ项是流动区域内,流动相的传质阻力.它指出流动相通过同一流路时,在接近固定相表面的流速比在流动相中间的要慢一些.(1)增大DM即组分在流动相的扩散系数;(2)减小填料的粒径;(3)减小流动相的流速.第49页,共80页，2024年2月25日，星期天★Ⅲ项表示分子扩散项.在液相色谱中,由于组分在液体中的扩散系数比在气相中小4～5个数量级,因此在液相色谱中,分子扩散项通常可以忽略不计.(1)减小DM即组分在流动相的扩散系数;(2)增大流动相的流速.

★Ⅳ项为固定相传质阻力.该项与气液色谱中固定相传质阻力项相同.(1)增大DS即组分在固定相的扩散系数;(2)减小df即固定相层的厚度;(3)减小流动相的流速.第50页,共80页，2024年2月25日，星期天★Ⅴ项是流动相停滞区域内的传质阻力.固定相孔穴中的流动相,一般是不移动的.流动相中溶质分子与固定相进行交换时,必须首先扩散进入滞留区.如固定相的微孔小且深,就会大大减慢传质速率.(1)增大DM即组分在流动相的扩散系数;(2)减小填料的粒径;(3)减小流动相的流速.第51页,共80页，2024年2月25日，星期天综合分析，提高液相色谱柱效的因素可归纳为：＊增大DM和DS即组分在流动相和固定相的扩散系数;减少填料的孔穴深度;采用低黏度的流动相;适当提高柱温;＊减小填料的粒径＊减小流动相的流速＊减小df即固定相层的厚度LC塔板高度的形式与GC一致，其主要区别在于扩展项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。第52页,共80页，2024年2月25日，星期天HuGC（a）LC（b）GC（a）——u有一最低点u最佳；u小或u大，H都大LC（b）——u没有最低点；u大，H增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度第53页,共80页，2024年2月25日，星期天二液相色谱中的柱外谱带展宽柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽：主要由进样所引起；b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.由于流动相在管壁邻近处的流速明显快于管中心区域的流速,从而导致柱外谱带展宽.为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.

第54页,共80页，2024年2月25日，星期天柱外效应对板高的总影响Hex可用下式表示:

式中,是流动相的线性流速,单位用cm·s-1;r是管子半径,单位用cm;DM是溶质在流动相中的扩散系数,单位用cm2·s-1.

采用低黏度的流动相;

适当提高柱温;

采用半径小的管道.第55页,共80页，2024年2月25日，星期天18.4组分分离—基本分离方程

柱效能和选择性柱效能—指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，Ｈ来描述。选择性—描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示.第56页,共80页，2024年2月25日，星期天色谱分离中的四种典型情况①分离效果差，柱效低，选择性（

）差②完全分离，柱效高，峰窄，选择性（

）差；③完全分离，选择性（

）好，柱效低，峰宽④完全分离，柱效高，选择性（

）好第57页,共80页，2024年2月25日，星期天一分离度Ｒ——色谱柱的总分离效能指标

1.定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的动力学因素。18.4.1分离度第58页,共80页，2024年2月25日，星期天

两个峰tR

相差越大，Y越窄，Ｒ值越大，说明分离较高。Ｒ≥１.5两个组分能完全分开。Ｒ＝１.0两组分能分开，满足分析要求。Ｒ＜１.0两峰有部分重叠。第59页,共80页，2024年2月25日，星期天分离度与柱效能，选择性的关系1）分离度R与柱效的关系

由色谱方程可得：18.4.2分离方程第60页,共80页，2024年2月25日，星期天2）分离度R与选择因子

的关系改变

的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。

3）分离度R分配比k的关系改变k

的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。第61页,共80页，2024年2月25日，星期天

例题1

已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；第62页,共80页，2024年2月25日，星期天解:(1)柱的分离度

(2)柱的平均塔板数

n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2

=3397n平均=(3493+3397)/2=3445第63页,共80页，2024年2月25日，星期天

例2:用一根2m长色谱柱将组分A、B分离，实验结果如下：空气保留时间30s；A峰保留时间230s；B峰保留时间250s；两峰的峰底宽25s。求：色谱柱的理论塔板数n；A、B各自的分配比；相对保留值α；两峰的分离度R；若将两峰完全分离，柱长应该是多少？

第64页,共80页，2024年2月25日，星期天[解]：n=16(tR/W)2=16(250/25)2=1600

kA=t′RA/tM=(230-30)/30=6.7

kB=t′RB/tM=(250-30)/30=7.3

α

=t′RB/t′RA=220/200=1.1

R=(t′RB-t′RA)/W=(220-200)/25=0.8L=n×H对同一个色谱柱,H是一定的

L∝n∝R2L=2×(1.5/0.8)2≈7m第65页,共80页，2024年2月25日，星期天18.5.1定性分析定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。

1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。

18.5定性和定量分析第66页,共80页，2024年2月25日，星期天第67页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）利用峰高增量定性若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值第68页,共80页，2024年2月25日，星期天2

其它定性方法—沸点规律

在一定色谱条件下,同族具有相同碳数的碳链异构体,其调整保留时间的对数与其沸点呈线性关系

lgtR’=A2Tb+C2

A2、C2

均为常数；Tb

为组分的沸点（K）根据同族同碳数碳链异构体中几个已知组分的调整保留值及其沸点，可推知同族中具有相同碳数的其它异构体的调整保留值第69页,共80页，2024年2月25日，星期天3.与其它分析仪器联用的定性方法小型化的色谱质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIde