第34章 DNA的复制和修复课件

第34章

DNA的复制和修复DNAReplicationandRepairDNAReplication第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

DNA复制

DNA修复合成

反转录DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。DNA生物合成第一节

DNA的生物合成DNA生物合成的方式：第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-（一）.DNA半保留复制

1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时，就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。

1、半保留复制(semiconservativereplication)：

定义：DNA复制的一种方式，每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。P408DNA复制具有两个特点：（半保留复制）和（半不连续复制）

一、DNA复制第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-弥散式possiblecopyingmechanismOFDNADNA复制方式有三种可能性：全保留、半保留和分散式。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

2.

DNA半保留复制的证明(两个)(1)

密度梯度离心

(重同位素标记）1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标记，同时可以否定另外两种复制方式第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-密度梯度离心第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-(2)

放射性同位素自显影•

1963年，Cairns设计了一个更为严谨的实验—放射自显影的方法，进一步证实了DNA的半保留复制；•

1957年，Taylor的实验证明，在真核生物中，DNA的复制也是半保留的 B:（双链标记）A和C:（单链标记）H3-标记的脱氧胸苷第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-•

单链DNA首先复制合成双链的复制型（单链DNA复制时，通常先形成双链复制型，再进行半保留复制）。

无论是复制、转录或逆转录，在形成双链螺旋分子时都是通过碱基配对来完成的。半保留复制非常普遍第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

DNA半保留复制的意义

意义：按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-1.设计实验证明DNA是半保留复制

-2012大连理工大学生物化学2.

猪流感病毒HRN1是反转录病毒，试想出实验方案以阻止病毒在细胞内复制而不影响细胞内DNA正常复制

-2012山东大学生物化学3.简述MettewMeselson和FranklinStahl设计了一个什么样的实验,证实DNA的复制是半保留复制思考题华东师范大学2007年生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题2010年南开大学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-（二）、半不连续复制（P418）（1）DNA聚合酶只能在5`→3`方向延长DNA（2）DNA是反向双螺旋

DNA聚合酶如何同时完成2条链的复制?

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-半不连续复制

定义：

DNA一条链连续合成和另一条链不连续合成的复制方式,称为DNA的半不连续复制。DNA聚合酶只能按5‘→3’方向催化合成DNA，不能催化3‘—5’方向合成,领头链随从链冈崎片段:引物第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-半不连续复制(续1)

领头链:对应3’—5‘的模板链，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。

随从链:对应5‘—3’的模板链，复制的方向与解链方向相反，复制不是连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。

冈崎片段:随从链中不连续的DNA片段称为冈崎片段。

原核生物:

1000~2000个核苷酸，相当于一个顺反子真核生物:

100~200个核苷酸（相当一个核小体）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题1.

是非判断题

DNA分子是由两条链组成，其中一条链作为前导链的模板，另一条链作为后随链的模板。

厦门大学2005年生物化学前导链和滞后链是针对某个复制叉而言的第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

思考题（1）如何证明冈崎片断的存在？（2）最初对冈崎片断测定的实验表明，其数量远超过新合成

DNA的一半，好象两条链都是不连续的，试分析原因？提示：（1）同位素标记dNTP，经过一段时间后终止合成，检查发现标记出现在小片段DNA上，且小片段

DNA分子量相同，数量较多。

（2）前导链会少量的dUMP掺入，后尿嘧啶碱基被切除形成AP位点，后该处磷酸二酯键打断，部分核苷酸，水解，造成一个缺口，后被修复，该过程会产生一些类似冈崎片断的DNA片段。P418第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dUTP一旦形成就被转化成dUMP

?dUTPase活性高低的影响？DNA复制DNA复制X第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-UUAAUUAA

解释糖苷酶(ung)+其他酶U等被切除（如果糖苷酶失活ung-，结果会如何？）判断：DNA聚合酶可以利用dUTP做底物。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

解释UUdenature

糖苷酶-

ung–

dump片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈奇片段AA

dut

–

dump片段越短dUTPase

DNA没有U！第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

解释E.colidUTPase，它能使

dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-解释(1)在dut-突变体（

dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut+中为短。这是因为U掺入机会增加；(2)在

ung-

（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。(3)

因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。在dut-,ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题1.细胞DNA复制是半不连续的，这是因为：

A.DNA聚合酶只能从3→5合成DNA链

B.模板双链是反平行的

C.DNA聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基

D.DNA酶法合成是个自发过程

南开大学2006年生物化学2.论述半保留复制和半不连续复制的过程

2011年天津大学生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题3.

DNA是以半保留方式进行复制的，如果放射性全标记的双链DNA分子在无放射性标记的溶液中经两次复制，那么所产生的4个DNA分子其放射性状况如何？A、两个分子含有放射性；

B、全部含有放射性；C、双链中各有一半含有放射性；D、所有分子的两条链都没有放射性。

华南理工大学2006年生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题3.

DNA复制时候后随链是冈崎片段，为什么前导链也是小片段

山东大学2010年生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-二、DNA复制的起点和方式

复制子:基因组中可以独立进行复制的单位，它包括DNA每条链的一个复制起点序列，可能还有一些终止序列。（复制在起始阶段进行调控,一旦起始，将复制下去，直到完成）1、原核生物和病毒为单复制子，真核生物为多复制子P408第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题

冈崎片段不是一个复制子，其起点也非复制起点第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

复制的类型和方式

复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。（1）、直线双向复制

单点双向：T7

多点双向：真核染色体DNA（2）、θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E.coli.）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

复制的类型和方式第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

首先将E.coli染色体，切成1%染色体长度的片段，分别进行（分子杂交），后放射自显影大肠杆菌OriC在liv位点P409

大肠杆菌复制起点：OriC（originof

Chromosomalreplication）2、复制往往具有一定的起点第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

复制的方向判断

先低放射性再高放射性（3H-脱氧胸苷）P409第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制起点的特点（1）复制起点较保守富含AT，含一些反向重复序列（2）两条链复制起点可以在不同的点上（如：D-环复制）（3）DNA复制的控制在起点控制，复制的速度决定于起始频率（延伸的速度比较恒定，不决定于培养基状况）DNA链的呼吸作用：DNA（复制原点处）氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-判断题1.通常DNA复制终止时并不需要特定的信号。(×)

中山大学2002年生物化学试题2.

真核生物DNA复制起点的序列专一性要低于细菌和病毒（×）.思考题第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-特殊的复制方式—滚环复制•

主要发生在病毒中,细菌F因子(Ffactor)；如φX174噬菌体

（单向复制？）•

在正链DNA上打开一个切口；•

以切口的3’-端为引物开始合成环链DNA的互补链，取代开环的链；3’-OHP410第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-滚环复制NOTE:cangetsingleunitgenomesormultimericcopies

单向复制

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-复制的类型和方式—滚环复制E.coliphage(噬菌体）:ΦX174“Template“rolls”,extrudesleadingstrandOkazakifragsmadeonleadingstrandasitemerges.

单向复制

？第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

特殊的复制方式-D环复制D环复制：

线粒体、叶绿体DNA（不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制，

（单向复制，全连续复制，没有冈崎片段）

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-•D-环扩充越过被取代链的复制起点；•被取代链启动复制，方向与第一条链相反；•两条链的合成没有冈崎片断单向复制，全连续复制

特殊的复制方式-D环复制第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

特殊的复制方式-2D环复制叶绿体DNA第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-复制的类型和方式—多复制叉复制

第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。

DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。

E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2X106/（50KbX2）=42]。富营养时，可采取多复制叉复制方式，结果20min可以复制一代。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

真核生物DNA的复制

真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。

1.一条染色体上具有多个复制子，同一染色体上，各复制子长度不同。2.不同生长期，复制子数目不同。如果蝇，生长旺盛期，细胞快速分裂，复制子数目可扩增十倍。3.每个复制起点在每个复制周期中只启动一次。4.

相邻复制子的终点是随机碰撞会合的。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-1.已知大肠杆菌在37摄氏度时双向复制一次约需40分钟，但在这些培养基内，细菌分裂可达20分钟一次，为什么？

中山大学2000年生物化学试题思考题2、名词解释：滚环复制2013山东大学3、判断：滚环复制是噬菌体DNA

在细菌中最常用的一种复制方式2008南京大学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-4、滚滚环复制（BDE）

A、是细胞DNA的主要复制方式。

B、可以使复制子大量扩增。

C、产生的复制子总是双链环状拷贝。

D、是噬菌体DNA在细菌中最通常的一种复制方式。

E、复制子中编码切口蛋白的基因的表达是自动调节的思考题第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-三、

DNA复制有关的酶及蛋白质因子底物：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP）模板（template）：解开成单链的DNA母链引物（primer）：提供3`-OH末端(体内为RNA,体外为DNA,如PCR反应)酶及蛋白质因子DNA聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶解链（解旋酶）类，单链结合蛋白引物酶，拓扑异构酶

DNA连接酶（P410）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

需4种dNTP（不是dNDP、dNMP、NTP）需DNA模板

需引物

(DNA、RNA)

5`→3`方向越长

（化学合成方向与此相反）

P413DNA聚合反应和聚合酶

DNA+dNTP=DNA(n+1)+PPi第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-āαDNA聚合酶反应的特点

DNA+dNTP=DNA-dNMP

+PPiɑ-磷酸dNTP第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题1.一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是第3位的磷，问是否能够达到目的。

2012年山东大学生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题2.

用放射性磷元素标记dNTP的ɑ-磷酸，参与DNA合成，分离后用检测其放射性以确定在合成过程中标记核苷酸掺入的量1）、这一过程的化学原理2）、如只标记一种dNTP放射性检测结果会有什么不同3）、如果在加入时不小心漏加了一种核苷酸，对放射性的影响4）、如标记其它位置的磷元素结果如何。

2012年山东大学生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

2.

大肠杆菌的DNA聚合酶DNA聚合酶：

DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅣDNA-polⅤ

依赖DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。（P414）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

（1）.大肠杆菌的DNA聚合酶

I

单链球状蛋白，含锌原子，多功能酶。①5`→

3`DNA聚合酶活力（使DNA链从5→3方向延长）②3→

5

核酸外切酶活力，起校正功能；③5→

3

核酸外切酶活力，切除引物或修复由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体；④聚合反应的逆反应（由3`端焦磷酸解）

DNA+dNTP=DNA-dNMP

+PPi第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

DNA复制过程中碱基对受双重校对（DNA聚合酶选择作用）（3`→5`外切酶的校对作用）DNA聚合酶的右手装结构没有校对作用的错误率：10-5，有校对作用的错误率5x10-7第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

3'→5'外切酶活性——校对作用某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低，起着促突变因子的作用。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3'→5'外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA聚合酶I的部分水解DNA-polⅠ木瓜蛋白酶N端C端小片段大片段/Klenow片段

53核酸外切酶活性

DNA聚合酶活性35

核酸外切酶活性（P414）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA聚合酶

I的特点

Klenow片段(Klenowfragment)：

E.coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5`-3`聚合酶和3`-5`外切酶活性，

Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

Sanger法（双脱氧非）DNA测序中使用Klenow片段优于全酶？最好使用没有校对活性的酶？第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA聚合酶I的功能

遗传学分析表明DNA聚合酶I复制速度慢，持续合成能力差，不是主要的复制酶，主要是参与引物切成或DNA的损伤修复第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-（2）.大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅱ

5′→3’聚合酶活性

3’→5′外切酶活性

无5’→3’外切酶活性它只是在无polI及polⅢ的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在损伤修复中有特殊作用。在DNA聚合酶

I活性低的细菌中发现,多亚基第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

(3).大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅲ①结构特点：含锌原子

由10种亚基组成不对称异源二聚体。核心酶（αεθ）

α亚基：5′→3′聚合酶活性

ε亚基：3′→5′外切酶活性和

碱基选择功能，是复制保真性所必需

θ亚基:可能起组装作用β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动,维持进行性γ-复合物：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性EpsilonTheta第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA聚合酶Ⅲ全酶功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-大肠杆菌的三种DNA聚合酶小节催化DNA聚合，主要复制酶参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数--+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolI突变后的致死性

可能？可能P414第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-（4）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ.

新近发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，参与易错链的修复。polIV:(encodedbydinBgene)

a)SOSrepairenzymeofdamagedDNApolV:(encodedbyumuD’2Cgene)a)SOSrepairenzymeofdamagedDNA第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

连接DNA链3

-OH末端和相邻

DNA链5

-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要提供能量

能量：细菌的连接酶利用NAD+。

能量：动物和噬菌体的连接酶利用ATPP4173.

DNA连接酶（DNAligase）

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-酶ATP(或NAD+)+酶ConnecttwoadjacentssDNAstrandsbyjoiningthe3´-OHofoneDNAstrandtothe5´-PofanotherDNAstrand.

DNA连接酶过程

P417共价催化共价的酶-AMP中间物第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-ThereactioncatalyzedbyDNAligase(1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-AMP中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)将酶-腺苷酸中间物上的AMP再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;(3)被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

细菌的连接酶只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。若DNA两股都有单链切口，只要缺口前后碱基互补也可连接

DNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用，是重要的工具酶之一。

DNA连接酶

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-4.

引物酶

(primerase)（P419）

前导链只需要一个引物，滞后链需要多个引物引物为一小段RNA第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

引物酶(primerase)

DNA聚合酶不能发动新链的起始，只能催化链的延伸-DNA合成需要引物，复制的引物为一小段RNA,冈崎片断的5’末端连接有小段RNA做引物,以提供自由的3’-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

∴(1)DNA合成除需要dNTP外，还需要(NTP)-引物需要，引物为RNA

(2)DNA复制需RNA聚合酶-（引物合成酶）,一种依赖DNA的RNA聚合酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-引物酶

•

引物酶对RNA聚合酶抑制剂不敏感，对利福平不敏感•引物酶,本身无活性,需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。大肠杆菌的引物酶：DnaG

合成引物50-100nt（长）真核生物的引物酶：DNA聚合酶a

合成引物10nt左右第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

DNA复制为什么要用引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？为什么引物为RNA?）

⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配

⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的3，→5，校对功能难发挥作用。

为什么需要引物第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-5.DNA复制的拓扑异构性质UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion

天然DNA存在着负超螺旋，这对于DNA分子的解旋非常由利。但随着复制的进行，复制叉前方的亲代DNA会形成正超螺旋，然会积累巨大的张力，这种张力主要是通过DNA拓扑异构酶作用消除的。P419第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制的拓扑异构性质拓扑异构酶Ⅰ:(与转录有关)切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。每一次催化作用可消除一个负超螺旋，L值增加1.反应不需ATP拓扑异构酶Ⅱ:(与复制有关)切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子引入负超螺旋状态。每次催化作用使L减少2，又称促旋酶。（DNAtopoisomerase）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-TypeItopoisomerases共价催化第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-TypeItopoisomerases共价催化第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-细菌中的旋转酶细菌中称为旋转酶（gyrase)，属于拓扑异构酶Ⅱ引入负超螺旋状态第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-Topoisomerasesasdrugtargets:

BecausedividingcellsrequiregreatertopoisomeraseactivityduetoincreasedDNAsynthesis,topoisomeraseinhibitorsareusedaschemotherapeuticagents.Camptothecin(喜树碱)--TopoIinhibitorDoxorubicin(阿霉素或多柔比星)--TopoIIinhibitor

ThesedrugsactbystablilzingtheDNA-Topoisomerasecomplex.Also,someantibioticsareinhibitorsofthebacterial-specifictoposisomeraseDNAgyrasee.g.ciprofloxacin喹诺酮类

杀菌与抗癌第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-6.

DNA解螺旋酶（解旋酶，解链酶）•

解链酶依赖于单链DNA，对单链DNA亲和力强•

解旋过程消耗ATP：2ATP/bp；具有ATPase活性

DnaB

蛋白在后随链模板沿5’→3’移动；•

Rep蛋白或PriA

蛋白沿前导链模板

3’→5’移动

DNA解螺旋酶（解旋酶）不是拓扑异构酶，细菌中拓扑异构酶称为旋转酶P421第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-7.单链DNA结合蛋白

四聚体的蛋白；与DNA单链发生结合；

结合具有协同效应稳定DNA解链后的单链状态，并保护核酸不被降解。使DNA的Tm下降真核生物中为Rp-A缺失会致死

SingleStrandDNABandingProtein(SSB)P421第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

四、原核生物DNA复制的过程复制过程分为：起始，延伸，终止三个基本步骤P421(一).

DNA复制的起始(initiation)

E.coli的复制起点OriC是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。大肠杆菌的复制起点（OriC）第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

E.coli复制起始点—oriC的序列特征

E.coli的复制起点OriC中有二个复制必需区域：4个是9bp重复序列，能与起始蛋白DnaA特异结合，对于DNA复制的起始十分重要；3个是个连续出现的13bp序列，富含A和T，有利于双螺旋DNA局部解旋并暴露两条复制模板链。富含A和T第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-原核生物DNA复制起始的相关蛋白质蛋白功能曾用名DnaA辨认复制起点

DnaB结合于DnaA,

提供解旋酶活性解螺旋酶DnaC与DnaB形成复合体

DnaG合成引物

引物酶

HU刺激起始，促进复合体形成

Gyrase解除正超螺旋，引入负超螺旋

旋转酶

SSB稳定单链DNA单链结合蛋白P422第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制的起始DnaBDnaGDnaC引发体(DnaB+DnaG)+ATPHU前引发复合物负超螺旋第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制的起始复制起始消耗ATP第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-复制的起始

复制的起始，要求DNA呈负超螺旋，这是因为DnaA只能与负超螺旋的DNA相结合，负超螺旋比正超螺旋有更好的模版作用。

复制的起始，要求起点附近的基因处于转录状态，RNA聚合酶对复制起始的作用，可能是因为其在起始点附近合成一段RNA，形成RNA突环，影响起点的结构，因而有利于DnaA的作用．第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

研究发现大肠杆菌DNA复制唯一一个受到调节的阶段为起始阶段，DNA的甲基化与细菌质膜的的作用可以影响复制起始的时间，DNA复制的发动与DNA甲基化和细菌质膜有关。大肠杆菌复制起点叫oriC，由245bp构成，在oriC中有11个含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使该序列中的A第6位N甲基化。

细菌DNA的复制调控发生在起始阶段P422第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

细菌DNA的复制调控发生在起始阶段oriC

的11个回文序列

半甲基化DNA不启动复制，因为oriC与膜结合DNA全部复制完并延迟一定时间后，子链DNA被甲基化新一轮复制第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

2.复制的延伸DNA聚合酶IIIDNA聚合酶IIIDNA聚合酶III引物引物引物前导链：DNA旋转酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

复制的延伸

前导链

(leadingstrand):以一条链(3′5′)为模板时,子代链的合成方向是5′3′,由引物酶在原点合成一条短RNA链，DNA多聚酶III结合于引物并加接脱氧核糖核苷酸残基一旦合成开始,前导链的合成便连续地进行,紧跟着复制叉移动,合成是连续的.

随后链

(laggingstrand):

以另一条亲代链(5′3′)为模板时,子代链的合成方向5′3′滞后链的合成是不连续的以短的冈崎片断的形式完成的,每合成一个冈崎片段都需起始一次,由引物酶合成一个引物.

第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

前导链合成一个引物,滞后链则合成许多冈崎片段的引物。在同一复制叉上，引物的合成前导链早于滞后链。引物第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-引物•

是短链RNA。（体外为PCR中DNA)•

长度一般：原核生物,10-60bp（长）真核生物,2-10bp(哺乳动物)

前导链引物长于滞后链冈崎片段引物•合成方向是5'→3'方向。•提供的3‘-OH，可在DNA-polⅢ催化下，利用dNTP

生成磷酸二酯键。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-后随链的模板在全酶上绕转180.形成一个小环

原核同一个DNA聚合酶III以二聚体形式在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-引发体(primosome)与引物合成

解链酶

DnaB有两个功能,其一是解螺旋酶;另一是活化引物合成酶（DnaG）,与DnaG引物合成酶构成一个基本功能单位,称为引发体（DnaB+DnaG），合成引物。在某些噬菌体DNA的复制过程中,引发体还包括一些辅助蛋白。P423第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制的延伸

引发体方向移动（与引物或冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-冈崎片段的连接

冈崎片段的连接:在DNA聚合酶Ⅰ的催化下,除去RNA引物,同时催化DNA片段继续延长至另一DNA片段的5'端，后在连接酶的催化下连接成完整的DNA分子。123第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-冈崎片段的连接切口平移DNA连接酶

DNApolIDNApolIIIDNApolIII

DNApolIDNA连接酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA切口平移所用的酶为（）。A、Klenow酶，B、Taq酶，C、DNA聚合酶ID、DNA连接酶NickTranslation（自学）切口平移中国科学院06年第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

拓扑异构酶细菌领头链和随从链的延长差异前导链：DNA旋转酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-细菌领头链和随从链的延长差异

前导链

滞后链前体dNTP:dATP,

dGTP,

dCTP,dTTPdNTP:dATP,dGTP,dCTP,dTTPNTP:ATP,GTP,CTP,UTP酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶，引物酶，DNA聚合酶Ⅰ，DNA连接酶和NAD+复制延伸过程中的各种原料、酶或蛋白质因子第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-)

复制体(replisome)

复制体：是在复制叉附近与DNA复制有关的酶和蛋白质因子，他们在复制叉上形成离散的复合物,彼此配合,进行高度精确的复制,这种结构称为复制体(DNApolⅢ二聚体、引发体和DnaB等)复制体的基本活动包括：1）双链的解开；2）RNA引物的合成；3）DNA链的延长；4）切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片段；5）切除和修复错配碱基。P421第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-3.E.coliDNA合成的终止现已发现有两个终止区域

（terE,D,A

和terC,B,F），

位于相遇点的另一侧100Kb

处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要Tus(36kD)，

Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。

ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-E.coliDNA合成的终止

ThetwonewlysynthesizedcircularchromosomalDNAs

aretopologicallyinterlinked(catenated)andisfinally

separatedbytheactionofaTypeIIopoisomerases.

最后还有50-100bp通过修复方式填补拓扑异构酶Ⅳ(termination)第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题1.在DNA复制过程中，两条新链的合成为何一条链是连续复制，另一条链是间断复制？并比较两条新链合成过程的不同点。

天津医科大学2006生物化学2.简述参与DNA复制的酶及基本过程复旦大学2003年考研生物化学3.细胞DNA复制是半不连续的，这是因为：

A.DNA聚合酶只能从3→5合成DNA链B.模版双链是反平行的C.DNA聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基D.DNA酶法合成是个自发过程南开大学2006年生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题4.

以下哪个过程不需要DNA连接酶?

(A)DNA复制(B)DNA修复(C)DNA重组

(D)制备重组DNA

(E)DNA修饰。5需要以RNA为引物的是:

(A)DNA复制(B)RNA转录

(C)转录

(D)蛋自质合成(E)RNA复制

华东师范大学2006生物化学考研6.叙述DNA聚合酶I在大肠杆菌细胞DNA复制中的功能，并介绍这个酶在生物技术中的应用。

南开大学2006年生物化学7.

原核生物DNA复制的过程

中国农业大学2011年生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题8.

关于DNA复制的叙述哪一项论述是错误的?()

A．有DNA指导的RNA聚酶参加，B．有RNA指导的DNA聚合酶参加，C.为半保留复制D.有DNA指导的DNA聚合酶参加

山东大学2001生物化学9.在一个复制叉之中，以下哪一种蛋白质的数量最多?()

（A）DNA聚合酶（B）引发酶（C）SSB

（D）DNA解链酶（E）DNA拓扑异构酶

华东师范大学2007年第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

思考题10、打开DNA超螺旋的酶或蛋白质是（）

A、DNA解螺旋酶B、单连结合蛋白C、DNA旋转酶D、DNA聚合酶1E、DNA聚合酶2

苏州大学2006年11、DNA连接酶在下列那一过程中不需要？

A、DNA复制B、制备重组DNA

C、DNA修复D、DNA断裂

厦门大学2011年第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-12、山东大学2015

名词解释:滚环复制

判断：1）.大肠杆菌DNA聚合酶I具5’-3’外切酶活性，也可以RNA为底物。2）.基因组DNA复制，先导链引物为DNA，后随链引物为RNA。3）.因所有的DNA聚合酶都按5’-3’催化链延长，因此推测必定存在一种未发现的酶能按3’-5’催化复制叉上第二条链使之延长。思考题第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

思考题13、大肠杆菌DNA复制和体外酶促扩增DNA的比较。中国药科大学20132.、为什么说DNA复制以5’-3’为模板的是半不连续复制，它如何完成复制过程。2015考研827生化回忆版_天津大学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-五

真核生物DNA复制P424

真核生物染色质的基本单位：核小体，核小体DNA长度200bp左右，真核生物冈崎片段较短的长度200bp左右，相当于一个核小体DNA长度多起点复制，酵母复制起点ARS第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的差异(1).真核生物复制慢：原核细胞DNA复制叉移动速度快，细菌复制叉移动速度为50000bp/min，哺乳动物DNA复制叉移动速度慢,约为1000~3000bp/min。(2).真核细胞含多个复制子，多个复制起点。人平均每个染色体上有1000个复制子，原核细胞DNA中多数只有一个复制子。(3).

真核细胞的复制子在每个细胞周期仅复制一次，原核细胞在快速生长时，在DNA复制起点可连续复制多次，(4).

引物和冈崎片段较短

(5).

连接酶需ATP

(6).

端粒的复制(7).

聚合酶和蛋白质因子不同。真核细胞DNA与组蛋白结合成核小体，原核细胞DNA不存在核小体。P425第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-（1）.Semi-conservativereplication（2）.Semi-discontinuousrepliction（3）.DNAhelicase（4）.RNApriming(5).

校对（Proofreading）(6).

单链结合蛋白真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的相同点2.原核生物与真核生物复制的差异2015年东北师范大学（851）生物化学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

真核生物的五种DNA聚合酶DNA-polⅢDNA-polⅠ类似原核生物DnaG,primase德尔塔伊普西龙在核酸酶切去引物后，补引物缺口合成引物：RNA+DNA主要的复制酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

真核生物的五种DNA聚合酶(1)DNA-pol

（核内）:起始引发，有引物酶活性。

（DNA-polα+primase形成紧密的复合物）(2)DNA-pol

（核内）:参与低保真度的复制。(3)DNA-pol

（德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶，有持续合成DNA链的活性又有校读功能,和组织相容抗原

PCNA)相互作用。(4)DNA-pol

（伊普西龙）（核内）:修复损伤DNA

和填补引物空隙的功能。(5)DNA-pol

（线粒体内）:在线粒体DNA复制中起作用。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA复制的起始起始DNA德尔塔第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

真核生物DNA复制的过程1、DNAPol

形成引物（RNA+DNA）2、两个DNAPol

（德尔塔）或一个DNAPol

与一个DNA-pol

（伊普西龙）在引物后延长DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除冈崎片段RNA引物的4.

DNA聚合酶ε填补缺口，类似细菌-DNA-polⅠ5.

DNA连接酶进行连接反应，需要ATP供能。DNA-pol

（德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶起作用。伊普西龙第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-真核生物引物的切除和补缺口FEN1又写为MF-1

pol

(伊普西龙)第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-真核和原核细胞的DNA复制比较

功能

E.coli

人复制酶PolⅢ的全酶Polδ进行性因子

夹子PCNA定位因子复合体RF-CSSB引物酶DnaGPolα-引发酶去除引物的酶

DNA聚合酶1

RNaseH1和MF-1后随连修复酶DNA聚合酶1和DNA聚合酶εDNA连接酶DNA连接酶1解旋酶DnaBT抗原消除拓扑张力酶旋转酶拓扑异构酶单链结合蛋白SSBRP-A起始蛋白DnaAT抗原

注：MF-1又写为FEN1P426第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-环状DNA

大肠杆菌能否完整复制真核生物链状染色体？线状DNA:滞后链复制不完整5端

DNA复制的末端第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-端粒和端粒酶端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体。端粒由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人TTAGGG，四膜虫为TTGGGG），富含G。端粒也被科学家称作“生命时钟”。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-端粒和端粒酶

人类端粒酶含三部分：（端粒酶RNA）、（端粒酶协同蛋白）、（端粒酶逆转录酶），除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外,大多数正常人体细胞失去端粒酶活性。恶性肿瘤细胞中,85%～90%端粒酶强阳性。端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.原核生物没有端粒酶端粒酶(telomerase):是一种反转录酶,修补端粒序列第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

由RNA（做模版）和蛋白质（逆转录酶）构成的一种核糖核蛋白复合体，维持端粒的长度。端粒酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-端粒的形成第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-六、

DNA复制的忠实性机制（补充）

DNA复制的差错率只有10-8－10-101.

DNA聚合酶的选择作用（根据碱基配对规律，但碱基有烯醇式和酮式两种构象）(104-105)2.DNA聚合酶本身具有校正功能(3'→5'外切酶活性)(102-103)

加入错配碱基后合成速率下降，为校对修复留出时间：动力学校对3.

细胞内有错配修复等损伤修复系统4.

细胞维持dNTP的平衡水平；5.

RNA作为合成引物（起始合成时易出错）；前导链和滞后链的忠实性程度往往不同DNA复制时，新链合成都遵循碱基配对原则！(102-103)第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-1.哪些机制保证了DNA复制的准确性？为什么生物体内转录的准确性没有DNA复制准确性高？

中国农业大学2012年生物化学2、判断：与原核生物不同，几乎所有的真核细胞都发现有端聚酶。2013年中山大学3.端粒酶是：

A、限制性内切酶

B、DNA聚合酶C、RNA聚合酶

D、肽酰基转移酶

厦门大学2011年招思考题第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题南开大学20102011年中国海洋大学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-6.判断：所有的冈崎片段都是从5'---3'方向合成，在3'端延长。

厦门大学2011年招7、下列与DNA解链无关的是？

A、单链DNA结合蛋白B、DNA解旋酶

C、DNA旋转酶D、DNA酶

南师大2013思考题8、原核生物复制叉上有何活动和需要什么酶华中科技大学生化2014第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-8、山东大学2015

简答：DNA复制方向5’-3’，若以3’dNTP为DNA复制原料，DNA复制方向可以是3’-5’。思考题5`活性5`端非活性3`端第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-5'3'复制方向的原因原因：(1).核苷酸均为5'核苷酸(2).错误碱基采取水解去除的方式（3）错误碱基去除后的主链可以直接进行下一轮反应PPPOH5'3'第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-PPPOH5'3'思PPPO5'3'PPPOH5'3'思5→3

聚合酶3→5外切酶123错误后校对可以直接进行下一轮反应5'3'复制方向的原因第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-PPPOH5'3'POH5'3'5`→3`聚合酶POH5'3'3→5外切酶PPPOH5'3'如果进行下一轮反应，5'需要重新活化123错误后校对3'→5'复制方向？最初第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-第二节DNA的损伤和修复

DNA损伤(DNAdamage)：是指DNA结构改变而引起的遗传信息的改变。DNA的自发性损伤碱基错配：碱基异构、脱氨基和修饰物理因素引发的损伤紫外线电离辐射化学因素引发的损伤碱基烷基化、碱基脱落等碱基类似物P427第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

DNA的损伤修复修复形式

损伤特点

pol

修复特点直接修复

不打断链，不切除错配修复修复复制错配碱基pol

Ⅲ切除可达1000nt碱基切除修复修复单个碱基损伤pol1先去除碱基，再切几个nt核苷酸切除修复修复较大的损伤pol1如，切除13或29ntSOS反应很大的损伤pol1

(Ⅳ/Ⅴ

)第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-错配修复(修复复制中错配的错误)

1、定义：在含有错配碱基对的分子中使正常的核苷酸序列恢复的修复方式。

2、参与错配修复的酶与蛋白质：

Dam甲基化酶;

MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶;

SSB;DNA聚合酶Ⅲ;DNA连接酶；

（一）DNA错配修复第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DnaBDnaGDnaCHU

DNA错配修复AC识别新生链中非m6A

的GATC序列DNA聚合酶Ⅲ;DNA连接酶；第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

大肠杆菌的错配修复过程第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-大肠杆菌的错配修复第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-

新合成的子代链未甲基化

几分钟后，新合成的子代链甲基化

大肠杆菌的复制起始的调控？第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-思考题2010年南开大学第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-(二)

DNA的直接修复

DNA直接修复:修复过程不要切除碱基或核苷酸1、光复活:可见光(最有效波长400nm)激活生物界广泛分布(高等哺乳动物,如人类，除外)的光复活酶,该酶分解嘧啶二聚体.是一种高度专一的修复形式,只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体.2

O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶:将DNA上的被修饰的甲基(鸟嘌呤O6位上的甲基)移到蛋白质的半胱氨酸残基上。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活,防止G-T对形成。第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-1、光复活

为什么细菌在紫外光照射后在可见光下比暗处更容易存活？川大生物化学2015年紫外线可以形成的胸腺嘧啶二聚体可见光可激活光复活酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-光复活酶的存在

光复活酶从单细胞生物到鸟类均有，高等哺乳动物没有此酶，而采用切除修复UV照射而形成的嘧啶二聚体。

为什么细菌在紫外光照射后在可见光下比暗处更容易存活？第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-2

O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶

Removesthemethylgroup.Themethylgroupistransferredtotheproteinitself,inactivatingtheprotein.第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-1、概念：在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。结构缺陷的修复：（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤的DNA。（3）DNA聚合酶1修复。（4）DNA连接酶连接。2、类型：（三）、切除修复（核苷酸）切除修复（碱基）切除修复

单个碱基缺陷的修复，如被碱基修饰，如烷基化结构较大变形第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-碱基切除修复AP位点(无嘌呤或无嘧啶位点）：DNA糖基化酶（糖苷键）可以切断这种碱基N-糖苷键，将碱基除去，形成的脱碱基部位通常称为"abasic"部位或AP位点。引发原因：DNA中U的出现，碱基的修饰，自发脱碱基等β-糖苷键AP位点的形成第34章-DNA的复制和修复-2015-5-11-DNA中可能出现U胸腺嘧啶核苷酸