高三生物血红蛋白的提取与分离课件

高三生物血红蛋白的提取与分离课件用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。二实验操作第2页,共64页，2024年2月25日，星期天蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定二实验操作第3页,共64页，2024年2月25日，星期天血液有哪些成分？第4页,共64页，2024年2月25日，星期天第5页,共64页，2024年2月25日，星期天血液血

浆水分其他

物质血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血

细胞白细胞血小板红细胞(最多)血红蛋白(90％)两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团血液有哪些成分？血红蛋白第6页,共64页，2024年2月25日，星期天第7页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤第8页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白第9页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间第10页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆第11页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色第12页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色五倍体积第13页,共64页，2024年2月25日，星期天①目的：去除()②方法：

()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色五倍体积生理盐水第14页,共64页，2024年2月25日，星期天初次离心后的结果第15页,共64页，2024年2月25日，星期天3次洗涤后的结果第16页,共64页，2024年2月25日，星期天

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放第17页,共64页，2024年2月25日，星期天

加()到()体积，再加40％体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。(2)血红蛋白的释放原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水第18页,共64页，2024年2月25日，星期天将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:(3)分离血红蛋白溶液第19页,共64页，2024年2月25日，星期天有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物分离血红蛋白溶液第20页,共64页，2024年2月25日，星期天(4)透析第21页,共64页，2024年2月25日，星期天取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液(4)透析1第22页,共64页，2024年2月25日，星期天第23页,共64页，2024年2月25日，星期天利用透析袋透析第24页,共64页，2024年2月25日，星期天2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。第25页,共64页，2024年2月25日，星期天②底塞的制作：

第26页,共64页，2024年2月25日，星期天②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

③顶塞的制作：④组装：⑤安装其他附属结构。第27页,共64页，2024年2月25日，星期天底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。注意第28页,共64页，2024年2月25日，星期天第29页,共64页，2024年2月25日，星期天2）凝胶色谱柱填料的处理第30页,共64页，2024年2月25日，星期天2）凝胶色谱柱填料的处理计算凝胶量配置凝胶悬浮液装填洗涤平衡第31页,共64页，2024年2月25日，星期天凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。注意第32页,共64页，2024年2月25日，星期天缓冲液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。注意第33页,共64页，2024年2月25日，星期天装配好的凝胶柱第34页,共64页，2024年2月25日，星期天在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？思考第35页,共64页，2024年2月25日，星期天在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。思考第36页,共64页，2024年2月25日，星期天你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考第37页,共64页，2024年2月25日，星期天

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？思考第38页,共64页，2024年2月25日，星期天3）样品加入与洗脱50cm高第39页,共64页，2024年2月25日，星期天3）样品加入与洗脱①缓冲液缓慢下降50cm高第40页,共64页，2024年2月25日，星期天②加透析样品第41页,共64页，2024年2月25日，星期天注意正确的加样操作：①不要触及破坏凝胶面②贴壁加样③使吸管管口沿管壁环绕移动注意第42页,共64页，2024年2月25日，星期天3）样品加入与洗脱①缓冲液缓慢下降50cm高③样品渗入凝胶床：④洗脱：⑤收集：②加透析样品第43页,共64页，2024年2月25日，星期天收集得到的纯化后的蛋白第44页,共64页，2024年2月25日，星期天AVSEQ08.DAT第45页,共64页，2024年2月25日，星期天

1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？三实验结果分析与评价第46页,共64页，2024年2月25日，星期天观察你处理的血液样品离心后是否分层？如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？三实验结果分析与评价第47页,共64页，2024年2月25日，星期天

2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？第48页,共64页，2024年2月25日，星期天

2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。第49页,共64页，2024年2月25日，星期天

3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？第50页,共64页，2024年2月25日，星期天如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？第51页,共64页，2024年2月25日，星期天

1.在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？思考第52页,共64页，2024年2月25日，星期天让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。

1.在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？思考第53页,共64页，2024年2月25日，星期天

2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？思考第54页,共64页，2024年2月25日，星期天

2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考第55页,共64页，2024年2月25日，星期天3.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？第56页,共64页，2024年2月25日，星期天3.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。第57页,共64页，2024年2月25日，星期天

1.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是

A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质

B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质

C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质

D.二者根本无法比较第58页,共64页，2024年2月25日，星期天

1.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白