【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定（核心工作）

第2节

基因工程的基本操作程序1基因表达载体的构建2目的基因的筛选与获取3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定四个步骤：基因表达载体的构建（核心）将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的筛选与获取基因工程的基本操作程序有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。

第2节

基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取1.目的基因（1）概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相

关的基因。主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子一资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因思考：1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。

Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因目的基因的筛选与获取2.筛选合适的目的基因方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对越来越多基因的功能和结构被分析。一苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害实例：利用PCR技术获取和扩增（重点）cDNA文库直接获取人工合成基因文库（P82了解）（化学合成法）：根据测序技术或从GenBank等序列数据库中掌握了目的基因的序列后，用DNA合成仪进行人工合成基因组文库从生物体内用限制酶直接得到获取目的基因的具体方法3.目的基因的获取目的基因的筛选与获取一基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。（1）从基因文库中直接获取3.目的基因的获取目的基因的筛选与获取一部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。目的基因的筛选与获取一提取基因组DNADNA片段重组载体基因组文库限制酶与载体连接导入受体菌提取特定组织或发育时期的mRNA单链DNA重组载体cDNA文库双链cDNA导入受体菌与载体连接DNA聚合酶逆转录酶基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子cDNA文库中的基因不含以上结构3.目的基因的获取（2）人工合成DNA合成仪①前提：基因比较小、核苷酸序列已知②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因3.目的基因的获取目的基因的筛选与获取一提取苏云金芽孢杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因（3）利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取一PCR——聚合酶链式反应PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。3.目的基因的获取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR技术：PCR是______________

的缩写，是一项根据___________的原理，在___

_提供参与DNA复制的___

____与__

____，对

_________________

_进行______

__的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因原理操作环境目的优点（3）利用PCR扩增目的基因目的基因的筛选与获取一结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？PCR扩增仪温故知新：回顾DNA的复制过程体内DNA复制过程解旋酶DNA聚合酶体内DNA复制需要模板、原料、引物、酶、能量等引物目的基因的筛选与获取一DNA复制的方向引物DNA母链DNA的复制方向总是从子链的5’端向3’端延伸引物从模板链3’端结合①DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）（2种）引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR扩增目的基因DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反相平行的，所以需要两种引物。复制原则:碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）引物①设计引物的依据是：

_______________________②引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：

________________________________________③使用的一对引物的序列相同吗？

_________________________________________④引物设计的要求（或引物失效的原因）

a._______________________________________b._______________________________________⑤每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因

______________________________⑥两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因

_____________________________________⑦两种引物都结合在DNA模板链的_____端脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸目的基因两端的核苷酸序列为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列*两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增3’防止引物自身环化防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合3’每种引物内部不能发生局部碱基互补配对两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物引物长度不宜过短，防止引物随机结合目的基因的筛选与获取一耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶②基本过程变性复性延伸①基本条件:（3）利用PCR扩增目的基因控制温度能量:热能，dNTP水解释放的能量③检测方法完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。(90℃以上）(50℃左右）(72℃左右）（含目的基因）dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？

如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核

糖。ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP

是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧

核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性90℃以上，双链DNA解聚为单链B.复性50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合C.延伸72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’目的基因的筛选与获取一②基本过程（3）利用PCR扩增目的基因碱基互补配对原则第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物目的基因的筛选与获取一②基本过程（3）利用PCR扩增目的基因PCR小结目的基因的筛选与获取一受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶(1)过程：（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出

个DNA片段，共需要引物数量为

个。指数2n2n＋1－2(2)DNA复制方向：

。5’端→3’端观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那么几轮循环后会出现只有目的基因片段（等长）的DNA分子？目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR获取和扩增目的基因③相关计算观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那么几轮循环后会出现只有目的基因片段（等长）的DNA分子？三轮目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR获取和扩增目的基因③相关计算思维拓展复制次数DNA分子总数01123n21=222=423=82n１)复制n次后DNA总数:2n2）含母链的DNA占总数的比例：22ｎ12ｎ-1=3）只含子链的DNA占总数的比例：

亲代DNA（2条链）无论DNA复制多少次，含母链的DNA数永远是2第1次复制第2次复制第3次复制2ｎ

-22ｎ思维拓展复制次数脱氧核苷酸链总数02123n2×21=42×22=82×23=162×2n=2n+1１)复制n次后脱氧核苷酸链总数:2）新合成的脱氧核苷酸链数：2n+1一个DNA分子中含有2条脱氧核苷酸链

亲代DNA（2条链）第1次复制第2次复制第3次复制2n+1-2②1个目的基因进行PCR扩增,循环n次，得到多少个目的基因？含引物的DNA分子有多少个？①1个DNA分子进行PCR扩增,循环n次，理论上至少需要多少个引物？2n思维拓展复制n次，需要的引物数=新合成的脱氧核苷酸链数找一找：复制n次，含有引物的脱氧核苷酸链有多少？2n+1-22n+1-2思维拓展一个DNA分子复制n次，则消耗的脱氧核苷酸数若亲代DNA分子含有胞嘧啶脱氧核苷酸m个，经过n次复制需要消耗胞嘧啶脱氧核苷酸数:m（2n-1）

第n次复制需胞嘧啶脱氧核苷酸数:m.2n-1

亲代DNA（2条链）第1次复制第2次复制第3次复制总的DNA数Xm-亲代DNA的m（原本就有的）

碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶、引物解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶DNA在高温下变性解旋大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR与DNA复制过程比较目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR扩增目的基因比较项目PCR细胞核内DNA复制场所试管中细胞内方式半保留全连续局部区域复制半保留半不连续全链复制起始位点引物3'端复制起始位点酶仅一种DNA聚合酶（Taq酶）多种酶反应条件温度变幅大温和解旋高温解旋解旋酶解旋引物DNA片段，保留在复制的子链中RNA片段，不保留在复制的子链中产物引物界定的片段核基因组循环次数人为设置与细胞分裂同步联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成补充2.PCR技术与细胞内DNA复制的比较目的基因的筛选与获取一1.下列有关体内DNA复制与PCR比较的叙述，正确的是A.二者合成子链的方向相同，均从5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制不需要引物，PCR反应需要引物D.二者遵循的碱基互补配对方式相同，且均需要ATP提供能量√学以致用

·链接典例拓展3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性90℃以上，双链DNA解聚为单链B.复性50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合C.延伸72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’目的基因的筛选与获取一②基本过程（3）利用PCR扩增目的基因碱基互补配对原则思维拓展新合成的脱氧核苷酸链上都有引物，即每个DNA都有引物找一找：①复制n次，含有引物的脱氧核苷酸链有多少？②复制n次，含有引物的DNA有多少？2n2n+1-2大本78题2小本141题13cd小本141题13cdef用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNADNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践实验原理（1）DNA片段的扩增①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。（2）DNA片段的电泳鉴定①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳

原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。加样孔电源琼脂糖凝胶电泳DNA片段的电泳鉴定材料用具（1）仪器（2）用具PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等PCR仪微量离心管微量移液器电泳装置方法步骤（1）DNA片段的扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后1次94℃,1min55℃,30s72℃,1min10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物I2.5μL20μmol/L的引物II2.5μLH2O28-33μL1~5U/μL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA5~10μL总体积50μL琼脂糖凝胶电泳的操作步骤配制琼脂糖溶液制备凝胶制备凝胶加样电泳观察记录DNA片段的扩增及电泳鉴定注意说明1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。结果：片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。1234561：Marker、标准大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循环次数的PCR产物6：清水琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取一2至5都为含目的基因的DNA片段,因为引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的DNA片段结合，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸应用：在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个体之间的亲缘关系。琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取一获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。构建基因表达载体（核心工作）基因表达载体由哪些部分组成二基因表达载体的构建1.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）紧挨转录的起点能控制表达所需要的特殊性状。位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片断）终止mRNA的转录用来鉴别或筛选含有目的基因的细胞基因表达载体的构建二DNA复制的起始位点，DNA聚合酶结合位点。=复制原点

+目的基因+启动子+终止子

+标记基因注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子

3.基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种二基因表达载体的构建培育抗虫棉的简要过程使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？问题探讨载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1思考：1、启动子和终止子分别是转录的起点和终点吗？提示：不是。启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子2、完成下表结果：片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。1234561：Marker、标准大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循环次数的PCR产物6：清水琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取一2至5都为含目的基因的DNA片段,因为引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的DNA片段结合，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸基因表达载体的构建复制原点标记基因KanR启动子多克隆位点终止子XbaIHindIIIBamHISmaIpBI121表达载体HindIII酶切HindIIIHindIIIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGGBt基因GGATCCGGGTTCGAA核心步骤HindIIIHindIIIBamHIAGCTTCCTAGGBt基因GGATCCATTCGAA同一种限制酶切CGATTAGCTTAAACGATTA

G

CTTA如何改进?DNA连接酶ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABt基因ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABt基因Bt基因Bt基因Bt基因Bt基因HindIIIBamHIAGCTTBt基因ACCTAGG用两种限制酶切CGATTGATCCGADNA连接酶GCGATAGTTCCGATCCAAGCTTAGBt基因HindIIIHindIIIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGGBt基因GGATCCGGGTTCGAA原则：1.限制酶切位点不得破坏目的基因和载体上的各类有功能的基因2.用两种酶切割，可以避免目的基因自接，质粒自身环化，目的基因与质粒倒接3.用于切割目的基因和质粒的限制酶必须是同种酶复制原点标记基因KanR启动子多克隆位点终止子XbaIHindIIIBamHISmaIpBI121表达载体小本137题9小本137题12大本73体验区

题1(2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，有人将此质粒用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

(1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______；并且_____

和____的细胞也是不能区分的，其原因是________________

_

。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有目的基因的重组质粒

二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素即含有重组质粒的大肠杆菌在其中不能生长，而含有普通质粒的大肠杆菌能生长．将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入原核细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（感受态细胞法）（我国科学家独创)将目的基因导入受体细胞三转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。（双子叶植物、裸子植物)（叶肉细胞)（受精卵)（大肠杆菌)基因枪法（单子叶植物)1.花粉管通道法或②在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法导入外源DNA将目的基因导入受体细胞三（一)将目的基因导入植物细胞是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。2.农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中重组DNA转入农杆菌农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中目的基因遗传特性稳定维持和表达农杆菌转化法步骤：将目的基因导入受体细胞三（一)将目的基因导入植物细胞构建基因表达载体Ti质粒目的基因含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA中植物细胞植物组织培养表现出新性状的植株总结：农杆菌转化法流程图该过程经过__次拼接、__次导入①第一次拼接_______________________________②第二次拼接______________________________________________________________③第一次导入__________________________________④第二次导入__________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）2.农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物将目的基因导入受体细胞三（一)将目的基因导入植物细胞

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。3.基因枪法适用于单子叶植物将目的基因导入受体细胞三（一)将目的基因导入植物细胞基因枪法意图1.显微注射法操作程序：（为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？)①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。将目的基因导入受体细胞三（二)将目的基因导入动物细胞提纯含目的基因表达载体受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物2.科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。将目的基因导入受体细胞三（二)将目的基因导入动物细胞使用Ca2+处理：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。过程微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入受体细胞三原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。（三)将目的基因导入原核细胞（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）常用菌：大肠杆菌Ca2+感受态细胞吸收返校要带的生物资料1.生物必修一《分子与细胞》教材2.选择性必修三单元复习清单默写（还没打印的同学要打印带回来）3.笔记本（大一点厚一点，一轮复习用）4.选择性必修三教材，大小本目的基因的检测与鉴定四在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？1.分子水平检测2.个体水平鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR技术或分子杂交技术抗原-抗体杂交技术（一)分子水平的检测1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA分子杂交（Southern-blot)流程图DNA分子杂交结果图目的基因的检测与鉴定四15N15N变性变性①首先取出转基因生物的基因组DNA；过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。（基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子2.检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或DNA-RNA分子杂交技术RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图Bt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳目的基因的检测与鉴定四（一)分子水平的检测用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。3.检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交目的基因的检测与鉴定四（一)分子水平的检测转Bt基因非转基因抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等采摘抗虫棉植株叶接种棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达目的基因的检测与鉴定四（二)个体水平的鉴定转基因生物检测方法观察指标抗虫植物害虫吞食害虫死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较细胞产物功能活性正常常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）目的基因的检测与鉴定四（二)个体水平的鉴定目的基因的检测与鉴定（小结)四类型步骤检测内容方法分子水平检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR扩增DNA分子杂交技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR扩增DNA-RNA分子杂交技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较

功能活性。目的基因的检测与鉴定四基因工程的基本操作程序获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增化学方法人工合成构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。基因工程的基本操作程序（4个步骤）单元网络构建一、目的基因的筛选与获取基因工程的基本操作程序1.筛选适合的目的基因：3.利用PCR获取和扩增目的基因：2.获取目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。直接获取，人工合成，利用PCR技术获取和扩增全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制DNA模板，4种脱氧核苷酸，2种引物，耐高温的DNA聚合酶，能量原理操作环境目的条件过程变性（90℃以上）→复性（50℃左右）→延伸（72℃左右）DNA合成方向5’端→3’端结果DNA数：2n,需要的引物数：2n＋1－2扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳单元网络构建基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建（核心）1.目的2.组成3.启动子4.终止子5.标记基因：6.描述基因表达载体的构建过程7.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的方法（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。=复制原点

+目的基因+启动子+终止子

+标记基因基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）紧挨转录的起点，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质基因的下游（一段特殊的DNA片断），终止mRNA的转录鉴定或筛选含有目的基因的受体细胞注意：1.限制酶切位点不得破坏目的基因和载体上的各类有功能的基因2.用于切割目的基因和质粒的限制酶必须是同种酶优点：可以避免目的基因自接，质粒自身环化，目的基因与质粒倒接双酶切单元网络构建

基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入原核细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（感受态细胞法）（我国科学家独创)（双子叶植物、裸子植物)基因枪法（单子叶植物)1.分子水平检测2.个体水平鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR扩增或分子杂交技术抗原-抗体杂交技术1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？

科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。

到社会中去2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？

科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的