固定化酶在食品工业中的应用

PAGEPAGE7固定化酶在食品工业中的应用摘要：生物技术是当今迅速发展的高新技术领域，是21世纪最具有发展潜力的新兴产业，涵盖了基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生物化学工程。固定化酶的研究源于80年前，但真正开展大量的研究是从20世纪50年代初开始，近年来，固定化酶在食品、制药、化学分析、环境保护等方面的应用越来越广泛。固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。随着科学技术的进步、经济的发展和人民生活水平的提高，人们对食品的组成成分、营养价值和感官要求也越来越高，食品工业不再是传统农业食品的概念，工业食品将在人们日常生活中占据重要的地位。固定化酶在理论与方法上的突飞猛进，推动、促进了生物技术从传统技术转化为高新技术，为食品工业的技术进步注入了新的活力。固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为其节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。本文介绍了固定化酶的定义、优缺点和固定的方法，以及对其在食品工业中的应用进行总结，并对其将来的应用前景进行了展望。关键词：固定化酶；食品工业；应用现状；前景展望一、固定化酶的定义和优缺点固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。与水溶性酶相比，优点如下：(1)易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化；(2)可以在较长时间内连续生产；(3)酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低；(4)酶反应条件容易控制；(5)较水溶性酶更适合于多酶反应；(6)可以增加产物的收率，提高产物质量；(7)酶的使用效率高，使用成本低；(8)适于产业化、连续化、自动化生产。与此同时，由于酶的分离、固定化处理等原因，固定化酶也具有一些难以避免的缺点：(1)在固定化过程中，酶活力会损失，尤其是胞内酶，预分离过程使酶活力损失较大；(2)生产成本提高，工厂初期投资大；(3)只能用于水溶性底物，而且较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；(4)不适宜于多酶反应，部分酶还需要辅助因子的协助才可以有效反应。二、固定化酶的方法酶的固定方法主要有吸附法、包埋法、共价键合法和一些其它方法，针对不同的酶，不同的载体需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联合使用。1、传统固定化技术1.1吸附法吸附法是通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶固定到载体（如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等）表面。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点。可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料，有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性。共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。吸附法制备固定化酶，操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。但酶与载体的结合不牢易于脱落，所以它的使用受到一定的限制。但是，吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易受反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。1.2包埋法包埋法是指酶或细胞包埋在各种多种载体（如明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等）中发生聚合、沉淀或凝胶化使之固定的方法。包埋法分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收，但发生化学反应时，酶易失活，适用于小分子底物和产物的酶。包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。1.3结合法结合法指选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。根据酶与载体结合的化学键的不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法通用的载体是各种离子交换剂，用离子键结合法制备的固定化酶，操作简便，活力损失少，但是结合不牢固，在pH值和离子强度等条件变化时，酶容易脱落。用共价结合法制备的固定化酶，结合牢固，酶不易脱落，可连续使用相当长的时间。但载体的活化操作比较复杂，因为结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。结合法制备固定化酶所用的高分子载体带有强的反应基团，如重氮盐、醛、酰氯、活性酯等活性基团，以保证酶的固化过程得以在比较温和的条件下进行。1.4交联法交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向德交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶。此法反应条件较剧烈，酶活回收率很低，故不常用。一般将吸附法和交联法两种方法结合起来使用。1.5热处理法将含酶细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的方法，称为热固定化法。热固定化法只适合于那些热稳定性较好的酶。在加热处理时，一定要掌握好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。2、新型固定化技术新型的酶固定化方法的原则是实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、纳米技术、超声波技术等新方法均可制备高活性固定化酶。2.1辐射处理射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。Co60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性，在微波辐射下以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基，然后将交联的壳聚糖球浸泡在脲酶溶液中24h，制备了壳聚糖球固定化脲酶，其酶比活为10183U/g载体。2.2纳米技术处理即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。为提高葡萄糖生物传感器的灵敏度，侯宪全等以纳米ZnO与聚乙烯醇缩丁醛（PVB）构成复合固定酶膜基质，采用溶胶-凝胶法固定葡萄糖氧化酶（GOD），用戊二醛进行交联，制成葡萄糖生物传感器。实验结果表明，GOD可牢固地固定在电极表面，在相同葡萄糖浓度下，加入纳米颗粒的电极的电流响应值比未加颗粒的高约100倍，电极重复使用46次后电流响应值仅下降到初始的70%。另有研究表明，泡沫陶瓷的纳米孔径分布非常适合脂肪酶的固定化，对固定化酶的催化效率有决定性的影响。经1h的固定化，泡沫陶瓷固定化酶的活力达商业化硅藻土固定化酶的1.33倍，体积活力为其2.63倍，蛋白载量45.36mg/g陶瓷，比活为1215.39U/g，活力回收为41.2%。泡沫陶瓷固定化脂肪酶在有机相乙酸乙酯合成中表现优良，连续使用5次，每次反应3h，乙酸转化率均在93%左右。2.3超声波处理在适当的超声场条件下，由于超声波的空穴和高频震荡作用，反应液中的底物和产物分子在超声波的驱使下，以较高的频率震动，固定化酶与底物和反应物的接触次数大大增加，促使底物和产物分子迅速进入和排出载体，从而使固定化酶的反应速度增加，活力增大。2.4电处理电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。蔡强等采用电化学聚合法制备聚苯胺膜，并通过静电吸附固定辣根过氧化物酶（HRP），形成聚苯胺修饰的HRP电极，聚苯胺在电极与酶分子之间传递电荷，这种酶电极H2O2的电流响应高达25A，响应时间小于15s。Rajesh等合成了聚（N-3-氨丙基吡咯-吡咯）（PAPCP）导电多孔膜，共价固定脲酶（Urs）后用作定量检测尿素的生物传感器，该传感器敏感度高、反应时间短、酶活性保持良好。三、固定化酶在食品工业中的应用1、应用于食品酶制剂的生产利用基因工程技术，不但可以成倍地提高酶的活力，而且还可将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因工程菌来生产酶。转基因微生物生产酶有许多优点，如产量高、品质均一、稳定性好、价格低等。第一个应用于食品的基因工程酶为凝乳酶，它是制造干酪过程中起凝乳作用的关键酶，传统来源是从小牛皱胃液中提取，造成全球性小牛短缺，酶成本不断提高。人们曾经尝试用微生物代用品或其他动物来源的凝乳酶，但效果均不理想；基因工程解决了这一难题。近20年来用基因工程菌发酵生产的食品酶制剂主要有：凝乳酶、α－淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、转化酶、普鲁多糖酶(茁霉多糖酶)、脂肪酶、α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、α－乙酰乳酸脱羧酶、溶菌酶、碱性蛋白酶等。2、固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种固定化酶，1973年就已应用在工业化生产，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。用淀粉生产高果糖浆包含三步：(1)用淀粉酶液化淀粉；(2)用糖化酶将其转化为葡萄糖，即糖化；(3)用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可得到含果糖55%的高果糖浆，当与蔗糖同等甜度时，其价格要低10%20%，因此具有经济推动力。高果糖浆用于替代蔗糖，目前世界上的产量约9000kt。固定化葡萄糖异构酶是固定化酶应用得很成功的工业实例，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶。该固定化酶常用的制备技术是热处理法，将含葡萄糖异构酶的放线菌、芽孢杆菌或链霉菌等细胞用6065℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶3、固定化酶在柑橘汁加工中的应用柑桔加工产品出现过度苦味是柑桔加工业中较重要的问题，苦味物质主要由2类物质组成：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A和D环）；另一类为果实中多种黄酮苷，其中柚皮苷为葡萄柚和苦橙等柑桔类果汁中的主要黄酮苷，柚皮苷的苦味与鼠李糖和葡萄糖连接键的分子构象有关。主要是利用不同的酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷生成不含苦味的物质。4、固定化酶在啤酒澄清中的应用啤酒以其清晰度高、泡沫适中、营养丰富和口感好成为人们的最佳选择。但是，由于啤酒中含有一定量的蛋白质，它与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，从而严重影响了啤酒的质量。温燕梅等采用吸附—交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对啤酒澄清防止冷浑浊有明显效果。赵炳超等在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCM248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳定性有了显著提高，固定化酶的pH值稳定性和储藏稳定性也有了明显改善。5、固定化酶用于水解牛奶中的乳糖牛奶中含有4.3%4.5%的乳糖。患乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解，用于连续化生产低乳糖奶，该技术已于1977年实现工业化。此外，乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰淇淋类产品中结晶，改善口感，增加甜度。固定化乳糖酶还可以用来分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖浆。6、固定化酶在烟叶中的应用在烤烟初烤和复烤后尚残留淀粉，淀粉在燃吸时影响燃烧速度和燃烧完全性，并产生糊焦气味，影响吸食品质。在一定条件下淀粉能水解为水溶性糖，使烟质改善。但这些反应并不充分，处理后的烟叶中淀粉含量仍很高，特别是低次烟叶中较高的淀粉含量影响了该类烟叶的可用性。加酶处理能加速淀粉水解，能将直链淀粉迅速降解为糊精和麦芽糖等，糖化酶能将直链淀粉和支链淀粉降解为葡萄糖。刘谋盛等将固定化-淀粉酶和糖化酶制成乳状液，用以降低低档次烟叶中淀粉的含量。由于酶被水溶性载体所形成的保护层包膜，避免了与空气直接接触，其活力得以提高，即强化了发酵条件，从而提高了卷烟的抽吸品质。同时，对固定化酶乳状液添加剂与水溶液酶添加剂降低低档次烟叶中淀粉的质量分数进行了研究，结果表明，固定化酶处理烟叶淀粉降解率为25%~30%，优于水溶液酶的25%，特别在抽吸品质方面，前者处理明显优于后者处理。7、固定化酶在食品检测以及传感器中的应用生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。如：测量电流以及电位的酶电极，酶热敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，以及生物发光及化学发光为基础的纤维—光学传感器等，不同的传感器都应用不同类型的固定化酶。食品中的农药残留分析越来越受到人们的关注，蔬菜中有机磷农药残留的快速检测已成为目前人们研究的热点。应用有机磷农药对胆碱酯酶特异性抑制的酶化学比色分析法已被广泛应用于有机磷农药的定性、定量检测。四、固定化技术在食品