GB4789.28-2024培养基和试剂的质量要求培训课件

食品国家安全标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求目录CATALOG01新版变化Change02培养基及试剂质量保证03测试菌株的保藏及使用04培养基和试剂的质量要求05培养基和试剂性能测试方法01新版变化本标准代替GB4789.28-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》。本标准与GB4789.28-2013相比,主要变化如下:——增加了附录E参比培养基的质控标准及质控菌株一览表;——增加了培养基性能测试方法流程图;——增加了附录G测试菌株中文名、拉丁名及编号一览表;——删除了纯化学培养基、未定义和部分定义的化学培养基、确证培养基;——修改了部分测试菌株;——修改了生产商和实验室使用商品化培养基和试剂的质量控制标准方法;——修改了附录F的菌株编号和名称。1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024/(删除)删除纯化学培养基和未定义和部分定义的化学培养基的定义1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024新增测试片的测试方法及评定标准、可以参照附录F，无法参照附录F部门，可以参考生产企业提供的操作说明来进行执行1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024实验室自制培养基，保存条件表述优化，平板、瓶装和试管装培养基建议保质期修改1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024修正之前错误的电阻率；对含有琼脂培养基在加热前溶解浸泡时间有了更为准确的时间1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024培养基分装体积与容器容积比例修改1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024修改3mm厚平皿倾注体积量，从18-20mL更改为15-20mL；修订冰箱存放温度；删除使用烘箱或培养箱对平板进行表面干燥1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024培养基和试剂质量评估要求进行的修正，规定了附录F中未描述的培养基和试剂质量控制要求1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024

对培养基微生物学要求，更为明确的指出如果生产商可以提供国家相关认证认可资质检验机构出具的同批次产品的检验报告可以按需进行重复测试；可以减少实验室培养基验收的工作量1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024因为霉菌菌落蔓延大，菌落多成片生长无法计数，因此，2024版菌液接种浓度更细化，对于细菌和酵母菌每板接种水平50-250CFU，霉菌每板接种水平30-150CFU。1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024工作菌悬液的制备，2013版只能从标准储备菌株接种，而2024版本可以从标准储备菌株、储备菌株或工作菌株中进行接种，描述更全面。1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024由于2013版6.2中固体培养基目标菌半定量划线接种在实际操作中存在较大的人为因素影响，可能导致评价结果的不一致性和不准确性。在新标准修订过程中经过深入研讨和比较，决定删除“2013版6.2中选择性固体培养基目标菌半定量测试方法”以及“2013版附录E”。统一了生厂商出厂检验和实验室对商品化培养基的验收标准，更客观科学评价培养基质量水平。/（删除）1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024新增几种不同类型培养基的验收方法流程图，使实验流程更加清晰直观/（无）1新版变化GB4789.28-2013GB4789.28-2024参比培养基需要通过国家认证认可资质检验机构出具的检验报告新增附录E参比培养基的质控标准，提供了SDA、TSA、MRS等参比培养基的配方、质控标准。/（无）1新版变化a）附录F食品微生物实验室使用培养基和试剂的质量控制标准新增28套培养基评价方法，补充GB4789.28-2013版后GB4789更新和新增的培养基试剂质控标准，如：溶血性链球菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌、创伤弧菌等检验培养基试剂以及致泻大肠埃希氏菌、肉毒梭菌等分子生物学检验实验试剂。b）GB4789.28-2013中包含21株国外菌株。然而，由于菌株的购买过程既耗时又昂贵，且受到生物制品流通限制的影响，获取这些国外菌株的难度日益加大。为了解决这一问题，从国内的CMCC（中国医学细菌保藏管理中心）、CICC（中国工业微生物菌种保藏管理中心）和GDMCC（广东省微生物菌种保藏管理中心）三大菌种保藏中心中选取菌株进行比对验证。从中选出了169株国内菌株，并与原有的21株国外菌株进行了全面的对比和验证。经过13家权威机构的验证，成功筛选出了21株国内菌株替代国外菌株。对于实验室已经拥有的培养基质控菌株，仍然可以继续使用。但是，如果在实验过程中需要使用新的菌株，或者当两种不同来源的菌株检测结果出现差异时，应以国内菌株的结果作为最终判定依据。此外，对于未来需要购买新菌株的实验室，建议按照GB4789.28-2024中提供的新编号菌株进行采购，附录G中同一序号菌种出现不同菌种编号，全部为同一株菌在三家菌种保藏管理中心同时注册获得。新版其他变化内容及原因02培养基及试剂质量保证培养基分类与定义能够允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生长的培养基；能够保证多种微生物生长的培养基；支持特定微生物生长而抑制其他微生物生长的分离培养基；对微生物没有选择性抑制的分离培养基；能够产生一个特定的鉴定反应而通常不需要进一步确证实验的培养基在初步复苏、分离和(或)增菌阶段后对微生物进行部分或完全鉴定或鉴别的培养基；培养基的定义：液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂)、鉴定或保持其活力的物质。02培养基及试剂质量保证CNAS-CL01-A001-2022检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明6.6外部提供的产品和服务6.6.2a)实验室应建立和保持有效的适合试验范围的培养基(试剂)验收程序。该程序包括对即用型培养基、商品化脱水合成培养基(包括完全培养基和需添加补充物的基础培养基)进行评估的方式和储存的规定、拒收的标准等。6.6.2c)对检测结果有影响的培养基和试剂应进行技术验收：1)对检测结果产生影响的关键培养基和试剂，要求进行技术性验收，食品微生物领域，应符合GB4789.28的规定。GB4789.28中未规定的，实验室应制定技术性验收标准。其他微生物检测领域，应符合相关领域标准要求，或可参考ISO11133或SN/T1538《培养基制备指南》。当有足够数据证明其可信性时，验收的技术性指标可以减少。实验室不得使用不符合要求的培养基和试剂。实验室应有关键培养基(试剂)的批号、入库日期、开启日期等的记录。2)针对即用型培养基、商品化脱水合成培养基，对每批培养基除用标准菌株进行测试验收，适用时，用人工污染实际样品进行检测，以更好地验证培养基的适用性；含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验。3)对每批生化试剂盒、测试条等关键试剂应采用标准菌株或其他有效方式进行测试验收。6.6.3a)实验室应保留生产厂商提供的培养基质量测试报告；要求厂商在培养基配方发生任何改变时应及时告知实验室。02培养基及试剂质量保证生产企业应提供以下资料(可提供电子文本)--培养基或试剂的各种成分、添加成分名称及产品编号:-批号;-pH(适用于培养基);-贮存信息和有效期;-标准要求及质控报告;-必要的安全和(或)危害数据。3.1证明文件3.1.2产品的交货验收（购入者）对每批产品,应记录接收日期,并检查:--产品合格证明材料;-包装的完整性;-产品的有效期;--其他必要的文件材料。厂家提供的文件本实验室的试剂验收记录本实验室的培养基验收记录根据3.1.2、3.2、5.2对于商品化脱水合成培养基的验收记录应记录以下信息1.产品合格证明材料2.密闭性3.有效期4.感官检查5.质量要求和测试结果02培养基及试剂质量保证培养基的实验室配制使用商品化脱水合成培养基制备培养基时,应严格按照厂商提供的使用说明配制,如质量(体积)、pH、制备日期,灭菌条件和操作步骤等。实验室使用各种基础成分制备培养基时,应按照配方准确配制,并记录相关信息,如培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)配制日期、人员等,以便溯源。配制用水要求：试验用水的电导率在25℃时不应超过25uS/cm(相当于电阻率≥0.04MΩ/cm),除非另有规定要求。试验用水的微生物污染不应超过103CFU/mL。应按GB4789.2定期检验微生物污染水平。pH的测定和调节：除特殊说明外,灭菌后pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为1mol/1,的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节培养基的PH。02培养基及试剂质量保证培养基的实验室配制注意事项1.培养基的熔化：可以放入沸水浴中或采用有相同效果的方法(如高压锅中的层流蒸汽)使之熔化。经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间。应尽快使用,放置时间不应超过4h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。2.培养基的贮存：凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或)2℃~8℃冰箱的密封袋中,以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记,标记的内容包括名称、制备日期和(或)有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。3.培养基的弃置：所有污染和未使用的培养基弃置应采用安全的方式,并且要符合相关法律法规的规定。03测试菌株的保藏及使用标准菌株的定义：直接从专业菌种保藏机构得并至少定义到属或种的水平的菌株。按菌株特性进行分类和描述，最好来源于食品或水或其生产环境中的菌株。标准储备菌株的定义：将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。储备菌株的定义：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。工作菌株的定义：由标准物质/标准样品或标准储备菌株、储备菌株转接一代获得的直接用于测试使用的菌株。注:标准物质/标准样品是指含有一定数量活菌,符合预期用途并足够均匀和稳定的材料。CNAS-CL01-A001：2022《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》实验室内对标准菌株要求依据：CNAS-CL01-A001:2022条款6.4.1.2图为制作标准储存菌株的流程a.通常悬浮于营养肉汤中适宜时间进行复苏。b.验证菌落形态和革兰氏染色或用生化试验进行鉴定。c.例如，TSB添加10%-15%甘油作为冷冻保护培养基。d.冻存管可含有多孔的小珠子。e.在不高于-70℃低温冷冻保存可延长保存的时间,禁止采用较高的温度保存。f.可作为工作菌株来使用。图为从标准储存菌株制备工作菌株的流程a.如果标准储存菌株来源于别处，应加以验证及归档。c.此流程对某些菌株是必须的，如定量试验。对所有阶段进行归档。d.例如，可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基，培养24h，然后在合适的温度(依据不同微生物在18℃—25℃或2℃—8℃)可存放4周。e.例如，TSB添加10%—15%甘油作为冷冻保护培养基。在不高于-70℃低温冷冻保存可延长保存的时间。禁止采用较高的温度保存。标准菌株的用途·标准菌株作为日常检测质量控制使用；·标准菌株用来验证准确度；·标准菌株作为已知物质验证新方法、新仪器；·标准菌株作为考核物质，评估检验人员的能力。传统的菌种保存方式·斜面保存法：微生物保存最基本的方法，可广泛用于细菌、真菌等，保存期限非常短，斜面容易干裂。·液体石蜡保存法：可用于保存霉菌、酵母菌、放线菌及需氧菌，方法简便，可防止斜面干燥和氧气进入，但一些固氮菌、分枝杆菌、毛霉、厌氧菌等不适宜用此法。·甘油冷冻保存法：用于一般细菌的保存，需使甘油终浓度为20%左右，然后-20℃或-70℃以下保存。融化时需要水浴溶化。·真空冷冻保存法：具有低温、干燥、无氧的保存条件，适用于98%以上菌种的保存，但操作复杂，一般实验室难以使用。·液氮保存法：基本所有微生物均可保存，并且保存时间长，但操作较为复杂而且需要设备，不适用于一般实验室保存菌种。·沙土保存法·半固体保存法·瓷珠菌种保存法瓷珠菌种保存法的原理瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，放置于-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境，使菌株处于“休眠”状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10年）冻存管的组成·冷冻管：体积小，1.8ml。·磁珠：内含25颗天然的多孔瓷珠，有利于细菌的吸附及保存。·冷冻保存液：冷冻保存液使菌株免受溶液和冰晶影响。瓷珠菌种保存管的使用1、标识：于管的标记处标记标准菌株编号。2、吸：吸取新鲜纯培养液，接入菌种保存管中。3、摇：拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇，以免沉淀于管底。4、吸：吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤。5、存：贴好封口膜，于-80℃冰箱保存注：标识：菌株名称-S-到货日期-菌株编号-储存代数-接种日期例：（如福氏志贺氏菌-S-20171204-ATCC12022-G1-20171208）标准菌株传代定义将菌种接种至新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。标准菌株传代流程标准菌株(冻干粉）G0标准储备菌株（G1，-80℃保存）复苏液（G2)菌株领用销毁工作菌株1（G3)工作菌株2（G3)工作菌株3（G3)工作菌株4（G3)菌株传代验证销毁记录表格包括三大块：传代与保存记录验证记录领用与销毁记录标准菌株编号与标签标准菌株编号规则

××××-G×-日期-序号菌株编号（如：ATCC12022)菌株传代次数（如：G1表示该菌株的第一代）菌株移接日期菌株移接次数号菌如下图，为编号及标签的例子：菌株名称：福氏志贺氏菌菌株编号：ATCC12022-G3-20190701-01载体：NA斜面保存条件：2~8℃移接人：XXX04培养基和试剂的质量要求4.1基本要求培养基和试剂的质量由基础成分的质量、制备过程的控制,微生物污染的消除及包装和贮存条件等因素所决定。供应商或制备者应对基础成分的质量、制备过程,微生物污染的消除及包装和贮存条件进行控制，确保培养基和试剂的理化特性满足相关标准的要求。培养基和试剂的各种成分、添加剂或选择剂应进行适当的质量评价，附录F中未描述的培养基和试剂,应根据以下规定进行质量控制:不含指示剂或选择剂的培养基,可根据培养基的使用范围选择菌株进行测试;含有指示剂和选择剂的培养基,应使用能证明指示剂和选择性功能的菌株进行测试;使用前需添加添加剂的培养基和鉴定试剂,应使用特征性的菌株进行测试。一般要求04培养基和试剂的质量要求4.2微生物学要求培养基和试剂应达到附录F质量控制标准的要求,其性能测试方法按第6章执行。实验室使用商品化培养基和试剂时,应保留生产商提供的资料,并制定验收程序。如果生产商能提供具备相应检验能力,并取得国家相关认证认可资质检验机构出具的同批次产品检验报告,实验室可保留相关证明文件,根据实际需求对该批次培养基的性能进行重复测试(附录下中未包含的培养基和试剂,可根据培养基和试剂的性能,参考附录下建立方法进行检验)。选择下列方法对每批成品培养基或试剂进行评价:一定量方法;—半定量方法;一定性方法。采用定量方法时,应使用参比培养基(见附录E)作为对照;采用半定量和定性方法时,使用能得到“阳性”结果的培养基作为对照有助于结果的解释。生长率按规定用适当方法将适量测试菌株的工作菌悬液接种至固体、半固体和液体培养基中每种培养基上菌株的生长率应达到所规定的最低限值(见附录F)。选择性为定量评估培养基的选择性,应按照规定以适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至选择性培养基和参比培养基中,培养基的选择性应达到规定值(见附录F)。生理生化特性（特异性）确定培养基的菌落形态特征、鉴别特性,或试剂的鉴别特性,以获得培养基或试剂的基本特性(见附录F)。若使用规定的所有测试菌株,培养基或试剂的性能测试达到标准要求,则该批培养基或试剂的性能测试结果符合规定。若基本要求和微生物学要求均符合规定,则该批培养基或试剂可被接受。达到最低限值达到规定值获得基本特性参比培养基定义：依据培养基配方特别制备,质量优良的培养基,用于培养基的质量控制,以保证食品微生物检验用培养基的质量。参比培养基需由具备相应检验能力,并取得通过国家认证认可资质检验机构出具的检测报告。4789.28中使用的参比培养基包括：沙氏葡萄糖琼脂（SDA）、MRS琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）参比培养基的检验方法可参考GB4789.28-20246.1或6.2.305培养基和试剂性能测试方法非选择性分离和计数固体培养基：计算生长率PR选择性分离和计数固体培养基：计算生长率、计算生长指数G、测试特异性非选择性增菌培养基：目测浊度值进行评定选择性增菌培养基：接种目标菌和非目标菌进行培养，后接种于选择性平板，根据平板生长情况评定选择性液体计数培养基：接种目标菌和非目标菌进行培养，后目测浊度值进行评定悬浮培养基和运输培养基：接种目标菌，分别在0分时和45分时吸取1ml倾注平板，培养后计算二者数量变化进行评定鉴定培养基：测试特异性实验试剂：测试特异性05培养基和试剂性能测试方法接种选择适宜稀释度的工作菌悬液0.1ml,均匀涂布接种于待测平板和参比平板。每一稀释度接种两个平板。也可使用螺旋涂布法或倾注法进行接种,并按标准规定的条件培养。计算

PR=Ns/NoPR-生长率;Ns--待测培养基平板上的菌落总数平均值:No--参比培养基平板上的菌落总数平均值。5.1固体培养基目标菌生长率定量测试05培养基和试剂性能测试方法

接种用1mL,接种环取选择性测试工作菌悬液1环,在待测培养基表面划六条平行直线(见图1)。计算培养后按以下方法对培养基计算生长指数G。每条有比较稠密菌落连续生长的划线计为1分,每个培养皿上最多为6分。如果仅一半的线有稠密菌落生长,则计为0.5分。如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱,则计为0分。记录每个平板的得分总和便得到G。结果解释非目标菌的生长指数G一般小于或等于1,至少应小于5.5.2固体培养基非目标菌(选择性)半定量测试05培养基和试剂性能测试方法接种用1μL接种环取工作菌悬液1环,在待测培养基表面分区划线。结果解释

观察生长情况和菌落特征。5.3固体培养基非目标菌(特异性)定性测试05培养基和试剂性能测试方法5.4非选择性增菌培养基半定量测试方法接种在装有待测培养基的试管中接