种子室内检验-品种纯度的电泳测定理论基础

不连续缓冲系统的电泳分离原理一、不连续缓冲系统的特点不连续缓冲系统的凝胶不同。在不连续缓冲系统中，样品加在孔径大的浓缩胶上，而浓缩胶则聚合在小孔径的分离胶之上。一、不连续缓冲系统的特点样品直接加在浓缩胶形成的小槽中一、不连续缓冲系统的特点不连续缓冲系统的主要优点是凝胶上可加体积相当大的蛋白质稀溶液，仍然可以使样品的各组分得到良好的分离。

蛋白质样品在小孔径的分离胶中分离之前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极狭窄的区带。我国当前应用的玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，就是利用4.65%浓缩胶，PH3.2；9.3%分离胶，PH5.6的不连续缓冲系统。二、不连续缓冲系统的电泳分离原理电泳分离样品浓缩效应样品分子筛效应电荷效应二、不连续缓冲系统的电泳分离原理——样品的浓缩效应浓缩胶为大孔径胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶为小孔径胶，样品在其中进行电荷效应和分子筛效应分离。

蛋白质分子在大孔径胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔径凝胶时的阻力大，速度就减慢了。

由于凝胶层的不连续性，因此在大孔径与小孔径凝胶的界面处就使蛋白质样品高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。二、不连续缓冲系统的电泳分离原理——样品的浓缩效应不连续系统浓缩效应示意图二、不连续缓冲系统的电泳分离原理——分子筛效应

样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。二、不连续缓冲系统的电泳分离原理——电荷效应

由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。

承载有效电荷多的，泳动的快，反之，则慢。电泳法测定品种纯度的程序电泳法测定品种纯度的程序药品的配制样品提取液凝胶溶液电极缓冲液样品的提取凝胶的制备加样和电泳染色和谱带分析染色液一、药液的配制染色液提取液电极液凝胶液一、样品的提取

不同电泳方法提取液和提取的程序不同，应按具体方法配制提取液和操作。1、清蛋白

能溶于水。包括大多数酶蛋白。通常可用同工酶电泳方法鉴定。

2、球蛋白

难溶于水，能溶于稀盐溶液；玉米盐溶蛋白电泳鉴定方法就是对球蛋白进行鉴定。

3、醇溶蛋白

不溶于水，但能溶于70～80％的乙醇。小麦和大麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4、谷蛋白

不溶于水、醇，可溶于稀酸、稀碱中。二、样品的提取二、样品的提取三、凝胶的制备1、连续电泳只有分离胶（小麦、大麦PAGE电泳）；2、不连续电泳有分离胶和浓缩胶（玉米盐溶蛋白电泳鉴定方法）。三、凝胶的制备样品梳取出后，将槽内残余的溶液用针管吸出。四、加样和电泳加样量应根据提取液中蛋白质的含量确定，一般10～30μl。四、加样和电泳1、电泳时一般采用稳压（农业部玉米盐溶蛋白电泳鉴定方法：稳压500V）。一般以凝胶板在电泳时不过热为准。2、电泳时为了指示电泳的过程，可加入指示剂，根据指示剂移动的速度确定电泳时间。

（1）对阳离子电泳系统（pH＜pI时，酸性电泳）：可用甲基绿作指示剂。点样端接正极，另一端接负极。即上端接正极，下端接负极。

（2）对阴离子电泳系统（pH＞pI时；碱性电泳）：用溴酚蓝作指示剂。点样端接负极，另一端接正极。即上端接负极，下端接正极。五、染色

蛋白质目前用得较多的染色液是10％三氯乙酸（可以10～12％）、0.05～0.1％考马斯亮蓝R—250，该染色液染色后一般不需要脱色。六、谱带分析1、根据蛋白谱带的组成及带型的一致性，区分本品种和异品种。2、

杂种F1表现为双亲共显性：即在父母本中所具有的蛋白质谱带，在F1代种子内同时出现，没有新的谱带产生。3、

根据互补带的有无区分自交粒和杂交粒。在互补带存在的条件下：

（1）如果同时出现了父母本所没有的谱带，可判为亲本不纯。

（2）如果互补带的二条有其中一条缺失，则为自交粒。

（3）如果整个带型与本品种有很大差异，则为杂粒。

电泳法测定品种纯度的原理一、蛋白质电泳及其分类

蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳

。电泳的种类繁多。电泳按支持介质可分为薄膜电泳、凝胶电泳（淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳）。二、电泳法测定品种纯度的遗传基础1、目前品种纯度鉴定主要以蛋白质为电泳对象

不同品种的遗传基础DNA不同，其转录、翻译而成的蛋白质也不同。因此，分析蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种的差异。

电泳法鉴定种子纯度主要利用电泳技术对品种的蛋白质的组分进行分析，找出品种间差异的生化指标，以此区分不同的品种，测定品种纯度。二、电泳法测定品种纯度的遗传基础2、蛋白质由数条氨基酸长链构成，而氨基酸为两性电解质

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理作为电泳支持物的聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺通过交联剂（N，N-亚甲基双丙烯酰胺）在催化剂作用下聚合而成的高分子胶状聚合物（三维网状结构的凝胶）。

聚丙稀酰胺凝胶电泳（简称PAGE）因其凝胶透明度高、弹性好、无吸附性、浓度易控制，被广泛应用于蛋白质的电泳分离。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理1、分子筛效应

由于蛋白质分子的大小、形状不同，在电场作用下通过一定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同，小分子较易通过，大分子较难通过，从而在电泳凝胶上被分开，即所谓的分子筛效应。

凝胶就如同一张多孔的“筛子”，这些“筛子”起着分子筛的作用，经过一定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分离。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理2、电荷效应

蛋白质带的电荷多少不同，受电场的作用力不同，带电荷多的分子受到的作用力大，移动较快；反之较慢。溶液的PH与蛋白质的PI相差越大，蛋白质带电荷越多。经过一定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分离。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理

不同分子大小和不同电荷蛋白质混合溶液放在凝胶的顶部，贯穿凝胶这一个电场，蛋白质就会因带电荷而开始移动，在电荷效应和分子筛效应作用下样品提取液蛋白质就被分离成一些不连续的谱带。

经过这样的电泳分离后，蛋白质谱带就停留在凝胶板上，肉眼是看不见的，通过染色剂染色，可显示出蛋白质谱带。不同品种电泳分离后所形成的谱带也不同，与对照（标准）品种比较后可判断出其他品种的种子数量，以达到鉴定品种纯度的目的。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理

蛋白质为两性电解质，在不同pH条件下所带电荷多少不同。对某一蛋白质来说，总有一个pH，带正电荷与负电荷多少一样，这个pH叫等电点（pI）。当pH＝pI（等电点）：电荷不移动。pH＞pI：碱性条件下，蛋白质将带负电荷。pH＜pI：酸性条件下，蛋白质将带正电荷。

不同的蛋白质由于氨基酸的组成不同，其等电点pI也不同。

蛋白质在一定pH下，不同的蛋白质所带电荷不同。在电场中受到的作用力大小有差异。电泳使用仪器一、电泳仪电泳仪是控制电泳系统电流电压的设备，使用电泳仪应注意：1、电泳仪属高压输出设备，通电后人体不要同时接触两端电极，以免触电。2、电泳时并联电泳槽的个数应视仪器电流负荷而定，切勿过载而损坏仪器。3、电泳仪不要空载开机，以免损坏仪器。4、不要在通电时接通或断开负载，以免产生火花，损伤接线柱或触电。5、使用中发现异常现象，应立即切断电源，进行检修。

二、电泳槽电泳槽是装配电泳支持物，放置电极缓冲液和控制电泳温度的装置。

种子鉴定使用较多的是夹芯式垂直板电泳槽，它具有凝胶用量少、灵敏度高、便于比较等特点，广泛应用于品种的电泳鉴定。三、离心机离心机是用于电泳样品提取液离心澄清的仪器。

一般农作物品种电泳鉴定要求转速为每分钟1~16000转的离心机。

核酸电泳则要求冷冻高速离心机。四、电子天平在配制电泳试剂时，必须称量准确。一般应配备精确度万分之一的电子天平。五、磁力搅拌器在配制电泳试剂时，用于搅拌试剂。六、微量进样器在电泳加样时，需用微量进样器。七、观片灯用于鉴定谱带八、其他仪器冰箱玻璃板架玻璃板八、其他仪器离心管架和离心管样品梳单粒种子粉碎器电泳图谱的分类和鉴别一、电泳谱带的分类1、根据谱带特征、血缘关系将电泳谱带分为两类（1）公共带指同种同属的不同品种，由于其起源进化的历史和生态条件相同，具有数目不等的相同的谱带。（2）特征谱带指不同品种之间所存在的稳定的可明确鉴别，可靠区分的遗传的谱带。一、电泳谱带的分类2、按杂交种的谱带的特征将电泳谱带分为四类（1）互补型谱带指杂交种具有来自母本谱带和父本谱带的一种谱带类型。（2）杂种型谱带指杂交种具有母本和父本所没有的，只有杂种才能具有的新产生的谱带。（3）偏母型谱带

指杂交种具有与母本基本相同的谱带。（4）偏父型谱带指杂交种具有与父本基本相同的谱带。

一、电泳谱带的分类鉴定不同杂交种的蛋白质电泳图谱一、电泳谱带的分类3、按电泳迁移的快慢将电泳谱带分为三类（1）快带指分子较小、形态光滑、带电荷较多、在电场中泳动最快、跑在前面的谱带。（2）慢带指分子较大、形状不规则、带电荷较少、在电场中泳动最慢、留在前面的谱带。

（3）中带指在电泳电场中泳动时，介于快带与慢带中间，泳动速度中等的谱带。

二、电泳图谱的分区

为了电泳图谱观察鉴定的方便，国内外通常将电泳图谱进行分区。

在分区时，可根据图谱中谱带分布和变化差异以及分界情况，进行区分。

区号通常可用希腊文字母或数字表示。电泳图谱的分区三、电泳图谱的鉴定1、谱带数目

不同品种的谱带数目可能不同。电泳图谱的分区三、电泳图谱的鉴定2、