纳米技术与基因疫苗的体内运送教材

纳米技术与基因疫苗

的体内运送1疫苗1.1疫苗简介是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗能刺激动物体免疫系统，引起特异性免疫反应，产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。1.2疫苗的种类①人工主动免疫持续时间较长，广泛用于预防传染性疾病。如灭活疫苗，减毒活疫苗，类毒素；②人工被动免疫持续时间短，主要用治疗和紧急预防，如抗毒素，人免疫球蛋白制剂，细胞因子制剂，单克隆抗体制剂；③新型疫苗主要是基因工程疫苗。如重组抗原疫苗，重组载体疫苗，DNA/RNA疫苗，转基因植物疫苗。2基因疫苗2.1基因疫苗简介基因疫苗又称核酸疫苗或DNA疫苗，是在基因治疗技术的基础上发展而来的。将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)与载体重组后,导入动物细胞内,使带有目的基因通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原蛋白的抗体，并引起特异的免疫应答以达到预防和治疗的目的2.2发展1990年Wolff等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。激活免疫系统的详细机制尚不十分清楚。一般认为，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主骨骼肌细胞或皮肤细胞后，可在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，经加工后形成的多肽抗原可与宿主细胞MHCⅠ类和Ⅱ类分子结合，并被提呈给宿主的免疫识别系统,从而可引起特异性体液和细胞免疫应答。2.3作用机制2.4与传统疫苗相比的优点制备简单，容易大量生产，成本低；非常稳定，易于贮存和运输，使用方便；质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应；在宿主体内的存在时间长，持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠；用核心蛋白保守DNA序列制备的基因疫苗对病原体的各变异亚型都可产生免疫应答，从而避免了因病原体变异而造成的免疫逃避问题；一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价苗，故一种基因疫苗可预防多种疾病。2.5DNA疫苗领域的研究进展(1)B型肝炎B型肝炎病毒(HBV)的DNA疫苗是目前被研究得最详细的DNA疫苗之一.现在B型肝炎疫苗的成分是以基因工程技术合成的S抗原制成，一般而言，这种疫苗的效果相当不错。但是免疫力正常的人仍有少于5%的人无法产生足够的抗体。研究发现，

用肌肉注射B型肝炎病毒DNA疫苗即可产生较好的免疫保护，同时产生抗HBV的抗体及细胞毒性T细胞反应。

除用在预防B型肝炎病毒感染，也有人用B型肝炎病毒DNA疫苗治B型肝炎，在B型肝炎病毒转殖鼠的研究当中，B型肝炎病毒DNA疫苗成功地诱发老鼠产生相应抗体，不但清除血液中的B型肝炎病毒表面抗原，肝细胞中B型肝炎病毒的mRNA也消失，同时并不会对肝细胞本身造成伤害。关于基因免疫的研究在世界范围内广泛展开，所涉及的范围包括人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病。目前，在医学上针对结核杆菌、艾滋病病毒、流感病毒等的基因疫苗已进入临床阶段；而针对乙型，丙型，戊型肝炎病毒、狂犬病病毒牛疱疹病毒、人乳头瘤病毒感染及相关癌症、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的核酸疫苗也正处于研究和开发之中。(2)流行性感冒病毒(Influenza)流行性感冒病毒的一个重要特征是它会不断的突变,主要是其表面蛋白会不断转变，出现新的病毒株，进而导致大规模的传染。现在的去活性疫苗注射必须预测可能的病毒株，然后再进疫苗的制造。一旦出现预测错误，或有新的病毒株出现，则现有的疫苗可能会无效。流行性感冒病毒的核蛋白(nucleoproteins,NP)相对比较少会有突变，可惜在自然感染下，核蛋白本身并不足以产生足够的免疫。针对流行性感冒病毒会不断突变的问题，曾经有人用含有流行性感冒病毒核蛋白基因的DNA疫苗，在鼠体内诱发出针对A型流行性感冒病毒的保护。如果能应用在人体身上，将是流行性感冒的预防工作上一个很重要的突破。(3)丙型肝炎DNA疫苗1996年，Major等将编码HBV核心蛋白的主要抗原决定簇基因与HBV主要蛋白基因融合，构建了重组HCVDNA疫苗，免疫接种小鼠后，成功地诱导了对两种抗原的免疫应答并检测到了两种病毒的抗体。同年，TobushigeK等将HCV核心蛋白基因的。DNA构建核酸疫苗后，免疫BALB／C小鼠后也产生了针对核心蛋白的免疫应答。(4)疟疾DNA疫苗

1994年Sedegah等构建的质粒DNA中含有编码尤氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCSP)的基因。该疫苗与目前试验中的疫苗(辐射处理的子孢子)相比，能诱导更高水平的抗PyCSP抗体和CTL，并使16只免疫小鼠中的9只获得了对疟原虫感染的防御作用。最近研究表明疟疾基因疫苗有可能成为最早用于人类的基因疫苗。直接注射法：质粒DNA直接从肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内注射。肌内注射是最为常用的免疫给药途径，但是DNA疫苗在这种情况下易被降解，利用率低。2.6基因疫苗的使用方法基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪将包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。这种方法效率高，免疫应答强烈，但操作复杂，需特殊设备。

细菌或病毒携带法：病毒载体对大多数靶细胞具有高效的转染率，但有制备复杂、有免疫原性、存在安全隐患等不足。口服、喷鼻或滴鼻法：能刺激粘膜免疫，对于经粘膜感染的疾病的防护效果好。但是胃肠道和鼻腔的代谢酶、pH会使质粒DNA降解。适宣的给药系统，减少药物的降解、提高细胞吸收非常重要2.7目前基因疫苗在使用中待解决的问题如何增强DNA疫苗的免疫效果等问题是当前DNA疫苗研究的国际热点问题。根据DNA疫苗的体内免疫机理，吞噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(AntigenPresentingCells，APCs)在DNA疫苗的转染、表达、提呈过程中发挥着极为重要的作用。理想的基因疫苗给药系统应满足以下几个方面：(1)保护基因一直到达靶细胞；(2)容易穿过细胞膜；(3)容易从内涵体释放；(4)保护基因不被核酸酶降解；(5)容易与基因解离。纳米技术是理想的答案吗？3纳米技术3.1纳米技术的简介在纳米尺寸上对物质和材料进行研究处理的技术称为纳米技术。纳米技术本质上是一种用单个原子、分子制造物质的技术。3.2纳米材料的特点表面效应、小尺寸/量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等。纳米材料的光学、磁学、力学、热学、电学以及化学性质和大块固体时相比将会有显著的不同。纳米管纳米树纳米花金纳米颗粒3.2.1纳米材料的表面效应指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。纳米颗粒的表面能高、活性强造成的性质变化高表面活性→交联或吸附性强吸附在细胞膜上胞吞作用进入细胞吸附药物/质粒DNA纳米粒纳米粒-药物/DNA复合物纳米载体-绿色荧光蛋白报道基因转染细胞3.2.2小尺寸/量子尺寸效应指由于颗粒尺寸变小所引起的宏观物理性质的变化。光学效应如不同大小的金颗粒和银颗粒具有不同的颜色磁学效应尺寸减小到6nm时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性。热学效应颗粒小于10纳米，其熔点将显著降低。力学效应呈纳米晶粒的金属要比传统的粗晶粒金属硬3～5倍。电子具有粒子性又具有波动性，因此存在隧道效应。纳米颗粒的一些宏观物理量，如颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量等，亦显示出隧道效应，称之为宏观的量子隧道效应。3.2.3宏观量子隧道效应3.3纳米技术的一些作用举例3.4纳米技术对于基因疫苗体内运送的作用纳米药物载体所具备的性质可生物降解，毒性较低具有靶向性具有较长的体内循环时间具有刺激相应控制释放性3.4.1脂质体应用于基因疫苗的运送

脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。用脂质体包裹DNA疫苗可通过非注射方式将DNA疫苗转运到动物或人体内。脂质体与其他运载体相比具有靶向性和淋巴定向性、缓释作用、提高主药稳定性等优点。因此，当用脂质体包裹DNA疫苗运输到体内时，可延长疫苗作用时间。脂质体的给药途径主要是静脉注射、肌内和皮下注射、口服给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药和鼻腔给药等。2006年，JérmeV等人应用一个新型脂质体(AVE3)转运抗原肽到皮肤抗原提呈细胞(APCs)。在注射点和淋巴结中，脂质体包裹的疫苗产生了长期表达。实验结果表明，用脂质体包裹的肽抗原能激活体内的树突状细胞，并产生强大的抗肿瘤免疫应答。3.4.2纳米微针用于DNA疫苗的注射

使用微针进行注射不仅能减少疼痛，而且安全度更高，因此它有望成为新一代的注射方法。此外，这种设备还能用于一些比较危险的疾病（如艾滋病）的DNA注射。Tattoo-美国科学家制造的一种微型注射器。纳米微针的针尖小于100纳米，只穿透对药物起屏障作用的角质层，使药物安全经皮释放，结合了注射和透皮给药两方面的优势,是药物缓控释领域的重大技术突破。3.4.3金粒包裹的DNA疫苗用于基因枪给药基因枪法通过动力系统将带有基因的金颗粒，将DNA吸附在表面，以一定的速度射进靶细胞，实现稳定转化的目的。KimHJ等人证实基因枪免疫无论是其介导产生的抗体效价还是其所需的DNA疫苗剂量，均优于肌注途径。Cui等用壳聚糖或其低聚物与羧甲基纤维素钠（CMC）制备阳离子纳米颗粒，将质粒DNA包被在这种颗粒表面，用于小鼠皮肤后，免疫效果显著的高于质粒DNA直接涂抹皮肤。而且这种纳米粒表面还可进行修饰提高体内的免疫效果。3.4.4壳聚糖纳米粒的应用