艾滋病的实验室检测流程

艾滋病的实验室检测流程艾滋病实验室检测流程样品种类及检测项目1.HIV抗体检测：涵盖全血、血清、血浆、口腔黏膜渗出液、尿液以及干血斑样品。2.HIV抗原检测：包括全血、血清、血浆以及病毒培养上清液。3.T淋巴细胞亚群测定：使用EDTA或肝素抗凝全血。4.HIV-1病毒载量、基因型、耐药检测：对血浆和滤纸干血斑(DBS)进行。5.HIV核酸定性与定量、基因型检测以及HIV-1分离培养：采用淋巴细胞富集液、外周血单核淋巴细胞(PBMC)及全血。值得注意的是，尽管如此多样化的样本可供检测，但实验室最常使用的仍然是血液标本，其他样本则仅作为补充。HIV抗体检测HIV抗体检测是艾滋病实验室检测的首选项目，在国内绝大多数初筛实验室中被广泛采用。1.初筛方法(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA法是目前最常用的HIV抗体检测方法，已发展到第四代，即同时检测血液中的HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。秉持着“宁可错杀一千，不可漏网一个”的精神，其灵敏度远高于特异性，使得HIV抗体无处藏匿。(2)化学发光或免疫荧光试验(CIA/IFA)近十年来迅速发展的新型检测方法之一，采用发光或荧光底物，可同时检测抗体和抗原。虽然灵敏度比ELISA有所提高，但也带来了检测成本增加和假阳性率上升的问题。(3)快速检测(RT)方法这类方法操作简便迅速，适用于紧急情况下的检测，如门诊急诊。然而，其灵敏度和特异性远不及ELISA和发光法，但价格相对实惠，因此在市场上也占有一定份额。主要方法包括明胶颗粒凝集试验(PA)、免疫渗滤试验以及免疫层析试验。2.确认实验(1)免疫印迹试验(WB)WB采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的HIV-1蛋白分离，经过一系列处理后，在硝酸纤维素膜上显示与特异抗原结合的抗体条带，从而确认抗体的存在。(2)条带/线性免疫试验(RIBA/LIA)其实验原理与WB法基本相同，此处不再赘述。HIV-1抗原检测1.筛查实验(1)酶联免疫吸附实验(ELISA法)即第四代抗原抗体联合检测试剂盒。通过将抗体包被固相反应孔(管)的底部，P24抗原与包被抗体形成复合物，再加入标记的HIV-1抗体与抗原结合，最后加底物显色，结果通过酶标仪读取。由于同时检测抗原抗体，使得灵敏度大大提高，有效缩短了HIV感染的检测窗口期，但试剂成本较高，普及推广面临一定难度。(2)酶联荧光分析法(ELFA)：待测样品的p24抗原与包被在固相孔(管)内的p24抗体结合，并被生物素标记的p24抗体识别。临床实验室应用前景不明朗，需要荧光检测设备，成本较高。(3)电化学发光法(ECLIA)：待测样品的p24抗原与包被抗体的磁性微粒和发光剂标记的抗体在反应管中温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。(4)抗原抗体快速检测法：同快速方法(RT)检测抗体，不同之处是用HIV抗体包被载体，检测灵敏度同样较差。2中和试验中和试验主要是p24抗原检测的补充试验，还可做HIV-1RNA的定性或定量检测，以排除筛查试验的假阳性。(1)酶联免疫吸附实验(ELISA法)：待检样品先与中和剂(p24抗原的抗体)共同孵育，如果样品中存在p24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。(2)酶联荧光分析法(ELFA)：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验(ELISA法)，中和率≥60%，认为样品中的p24抗原是真阳性。(3)电化学发光法(ECLIA)：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验(ELISA法)，中和率大于50%，认为样品中的p24抗原是真阳性。HIV核酸检测目前国内HIV核酸检测试剂主要为Taqman实时荧光PCR检测试剂，可检测血浆、血清、组织器官或血液制品的HIV-1RNA和DNA，DBS可用于检测RNA/DNA。全球目前正式用于临床诊断HIV-1急性期感染的核酸检测试剂比较少，主要是美国FDA批准的Gen-Probe公司生产的AptimaHIV-1RNA核酸定性检测试剂和欧盟批准的AbbottM2000HIV-1RNA/DNA定性检测试剂。临床诊断相关的检测策略及结果报告HIV检测阳性结果的检测过程一般经历两个阶段，初筛和复检程序。以HIV抗体检测为例，具体流程如下：试剂1进行初筛，结果无反应，报告「HIV抗体阴性」;结果有反应，不能出具阳性报告，必须进入复检试验。对初筛有反应的样品，用原有试剂双份或双孔进行复检试验(或者两种试剂复检)，如均无反应，报告「HIV抗体阴性」;如均有反应或一个有反应一个无反应，进行补充试验(抗体确证试验和HIV-1核酸试验)，报告HIV感染待确定。目前大部分临床实验室为艾滋病初筛实验室，开展常规初筛实验，发现阳性结果初步复检后送省市CDC或当地其他确认实验室做确认实验。临床诊断筛查检测流程见下图：目前国内实验室多采用