动物疫病诊断技术　第2部分：α疱疹病毒-地方标准编制说明

1《动物疫病诊断技术第2部分：α疱疹病毒》编制说明一、工作简况（一）任务来源本标准根据山东省市场监督管理局2022年下达的《全省标准化创新发展项目计划的通知》立项，鲁市监标函[2022]247号文件。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。马，驴等大动物疫病防控的权威科研人员和基层从业人员，对全省规模化猪场，鸡场，牛场，驴场以及马场的疫病情况比较熟悉。同时，也积累了可靠的数据和具有实际应用价值的技术经验，为此标准的制定奠定了基础。（二）起草单位、起草人及任务分工（1）起草单位聊城大学、山东农业大学、青岛农业大学、聊城市东昌府区农业农村局、青岛立见生物科技有限公司、山东省滨州畜牧兽医研究院、山东畜牧兽医职业学院、德州市农业综合执法支队、烟台市农村经济经营管理站、阳信县畜牧兽医管理服务中心、山东凤祥股份有限公司、临沂泽润牧业有限责2任公司、东阿阿胶股份有限公司和隆铭牛（日照）肉牛养殖有限公司。（2）起草人及任务分工李亮亮：聊城大学，主持标准制定，负责汇总编写本标准全部内容。李玉保、王彤彤、刘文强、王长法、刘桂芹、赵霞：聊城大学，参与标准制定，负责编写马疱疹病毒病和鸡疱疹病毒病感染相关材料。王刚：山东农业大学，参与标准制定，负责编写猪伪狂犬病相关材料。曹学香：聊城市东昌府区农业农村局，参与调研山东省内马疱疹病毒病流行情况。孙荣钊：青岛立见生物科技有限公司，参与编写猪伪狂犬病和鸡疱疹病毒病相关材料。刘焕奇、任慧英、胡学远：青岛农业大学，参与标准制定，负责编写牛疱疹病毒病相关材料。王志远，董建宝：山东畜牧兽医职业技术学院，参与编写猪伪狂犬病和马疱疹病毒病相关材料。肖跃强：山东省滨州畜牧兽医研究院，参与编写牛疱疹病毒病相关材料。申艳玮：德州市农业综合执法支队，参与调研山东省内猪伪狂犬病和鸡疱疹病毒病流行情况。刘洪明：烟台市农村经济经营管理站，参与调研山东省内牛3疱疹病毒病流行情况。王玉燕：阳信县畜牧兽医管理服务中心，参与调研猪伪狂犬病和鸡疱疹病毒病流行情况。徐江涛：山东凤祥股份有限公司，参与编写马立克氏病相关材料。邱洪凯：临沂泽润牧业有限责任公司，参与编写猪伪狂犬病相关材料。嵇传良、于杰：东阿阿胶股份有限公司，参与编写马疱疹病毒病相关材料。迟浩帅：隆铭牛（日照）肉牛养殖有限公司，参与编写牛疱疹病毒病相关材料。（三）起草过程2022年11月-2023年1月标准制定小组广泛查阅国内外有关猪，鸡，牛，马和驴α疱疹病毒研究的相关文献、标准和权威部门出版物，对相关研究成果进行了全面汇总，准备申报工作。2023年2月-2023年3月标准制定小组结合山东省内规模化养猪企业，养鸡企业，养牛企业，养马企业，养驴企业α疱疹病毒病发生的实际情况，编制了《动物疫病诊断技术第二部分：α疱疹病毒》草案，形成征求意见稿。2023年4月-2023年6月以函审的方式广泛征求来自东北农业大学，中国农科院哈尔滨兽医研究所，中国农科院上海兽医研究所，山东畜牧总站，安徽农业大学，山东省农业4科学院畜牧兽医研究所，新疆畜牧科学院畜牧研究所等高校科研院所的专家和阳谷荣发牧业，高唐县阿多宝畜禽养殖专业合作社等有关企业技术人员的意见，先后发出30条，回函的单位或专家数为22个，通过意见反馈，进行对标准内容和编制说明进一步修改和完善，形成送审稿。2023年7月-2023年9月，进行企业回归验证；9月7日在省畜牧局在济南召开了山东省地方标准组织专家审查会议，省市场监督管理局对审查会进行监督指导，来自山东师范大学、山东省动物疾病与控制中心等单位的9名专家提出标准内容删减，格式修改等意见，起草小组根据审查意见对标准文本进行修改完善，审查委员会对修改内容确认无误，最终形成报批稿。二、地方标准制定目的和意义疱疹病毒（herpesviruses）是一类有囊膜、基因组为双链DNA的病毒。主要分为α疱疹病毒、β疱疹病毒、γ疱疹病毒3种亚型。其中α疱疹病毒对动物的危害程度最大。该类病毒宿主广泛，包括猪、鸡、牛、马和驴等多种动物，且在国内外均有分布。随着国内畜牧业规模化、集约化发展，畜禽疫病发病率逐年上升，疫病防控仍是现阶段的一大难题。动物疫病的诊断作为动物疫病防控的重要组成部分，是控制疫病发生的主要手段。因此，针对主要动物疫病的病原制定相应的诊断标准，有利于推动相关动物疫病的监测与管理，尤其是疫病诊5断标准的实施，可降低疫病在本区发生概率。山东作为国内畜牧业生产大省，生猪、鸡、牛、以及特色畜种驴、马的饲养量年位居全国前列。近年来，以猪伪狂犬病毒，鸡疱疹病毒2型，牛疱疹病毒1型，以及马疱疹病毒1/4/8型为代表的α疱疹病毒在规模化养殖场肆虐，给畜禽养殖场带来巨大牛疱疹病毒1型，以及马疱疹病毒1/4/8型制定诊断标准，用于指导基层生产实践。本文件旨在规定猪、鸡、牛以及马属动物疱疹病毒的临床特征和实验室诊断方法。可用于指导规模化畜禽养殖场该类病毒的诊断和检测。标准的制定和推广应用有助于在规模化养殖场有效诊断该病，做到及早发现，尽早采取干预措施，减少经济损失，以利于提高动物生产性能，增加企业的经济效益。有利于提高我省对该类动物疱疹病的综合防治水平，最终推动我省畜牧业经济的可持续发展。综上所述，根据前期山东省多地区规模化养殖场α疱疹病毒发病率统计，基于养殖场生物安全规范和预防为主的原则，有针对性制定《动物疫病诊断技术第二部分：α疱疹病毒》的地方标准，涵盖伪狂犬病毒，鸡疱疹病毒2型，牛疱疹病毒1型以及马疱疹病毒1/4/8型等的诊断方法，来规范规模化畜禽养殖场对该类病毒的诊断与防控，最大限度地减少此类疱疹病毒感染造成的巨大危害，提高企业的经济效6三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准编制原则《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的规定起草，主要遵循：先进性、规范性、实用性、统一性和协调性等原则。结合山东省规模化畜禽场猪伪狂犬病，鸡马立克氏病，牛传染性鼻气管炎，马鼻肺炎等发病情况，特编制针对猪，牛和马，驴疱疹病毒的诊断技术规范，填补了我省这方面的空白。同时对于基层临床疾病的防控具有指导意义。（二）主要技术内容1.术语与定义本标准没有需要界定的术语和定义。2.1猪伪狂犬病该病由猪伪狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，PRV）引起猪的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，患病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。本病最主要的传播途径为空气传播，另外，在猪群中也存在鼻分泌物传播为狂犬病毒的现象。该病流行具有季节性，常发生在寒冷的季节。2.2鸡马立克氏病7该病由鸡疱疹病毒2型（GallidAlphaherpesvirus2，GaHV-2即马立克氏病病毒（Marek’sdiseasevirus,MDV）引起鸡的一种淋巴细胞增生性疾病。病鸡和带毒鸡是传染来源，本病主要通过空气传播，另外污染的饲料和饮水，以及饲养人员流动也可传播带毒。本病主要是2-5月龄鸡常发。2.3牛传染性鼻气管炎引起牛的一种接触性传染病。病牛和带毒牛是主要传染源，病毒主要存在于鼻、眼、阴道分泌物和排泄物中。本病主要由飞沫经呼吸道传播，另外可通过生殖道黏膜、眼结膜传播。该病常发于秋、冬寒冷季节。2.4马鼻肺炎type,EHV-1/4/8）感染引起的一种急性、热性传染病。该病的主要传染源是病马或驴和恢复后的带毒马或驴,病毒可存在于患病动物的血液、鼻液及流产的胎膜和胎儿组织中,部分公马或驴的精液中也可带毒。本病主要经呼吸道传染，另外，消化道及交配也可传染。该病多发生于秋冬和早春。3.1临床诊断3.1.1猪伪狂犬病该病的潜伏期一般为2～6天，刚配种的母猪发病时易出现8隐形流产；母猪发病早期无显著症状，妊娠母猪分娩前或后1周出现食欲下降甚至废绝，且出现早产、流产，产死胎或弱胎；公猪出现睾丸萎缩、阴囊肿大，精子活力低。哺乳仔猪感染以后出现高热，抽搐、震颤和共济失调等神经症状。3.1.2鸡马立克氏病该病的潜伏期一般为3～4周，可根据疱疹病毒侵害部位的不同分为四种类型。①神经型患病鸡出现站立不稳，呈“劈叉”姿势，为典型症状。翅膀下垂；低头或斜颈等。②内脏型常见于50～70日龄的鸡，病鸡精神萎顿，食欲减退，消瘦，羽毛松乱，鸡冠苍白或黑紫色、皱缩，伴有黄白色或黄绿色下痢常因脱水导致死亡。③眼型病鸡出现瞳孔缩小，虹膜边缘不整齐，颜色常为灰白色。轻者对光线强度的反应迟钝，重者失明。④皮肤型病鸡常出现毛囊肿大或皮肤结节。3.1.3牛传染性鼻气管炎本病潜伏期为7天左右，将本病根据疱疹病毒侵害部位的不同分为四种类型：①呼吸道型病牛体温升至40℃以上，鼻粘膜充血，出现散发性小脓疱，出现咳嗽，呼吸困难，咽下障碍。②结膜角膜炎型病牛出现结膜和角膜充血，眼睑肿大，流泪，角膜浑浊，有坏死性斑点。9③生殖器型母牛病牛体温升高，精神沉郁，食欲废绝，外阴肿胀有小脓疱；出现子宫炎导致流产，产死胎。公牛感染出现传染性脓疱型包皮龟头炎，丧失配种能力。④脑膜炎型以6月龄以内的犊牛已发，体温升高，出现惊厥，共济失调，角弓反张等现象。3.1.4马鼻肺炎本病潜伏期为2-10天左右，主要导致马属动物出现鼻肺炎，孕畜流产，以及神经症状。患病动物初期体温升高，流鼻液，鼻黏膜，眼结膜充血，下颌淋巴结肿大，同时血液中白细胞数量明显减少，感染严重者因呼吸困难而死亡。孕马或驴出现流产，或驴驹死亡。以1～2岁马或驴多发,3岁后呈隐性感染。3.2实验室诊断3.2.1猪伪狂犬病病料样品采集采集患病猪的鼻拭子、血液、肺组织、淋巴结、脑和扁桃体等组织，参考NY∕T541要求进行。聚合酶链式反应（PCR）检测与电泳分析取200uL鼻拭子或病料组织的上清液借助商品化试剂盒制备DNA，鉴于PRV的检测需要鉴别是自然野毒感染还是人工疫苗免疫。利用特异性引物分别进行PCR扩增（引物序列参见表1，其中gE引物用于野毒鉴别，gB引物用于常规检测）,具体操作步骤参照附录A。目的片段大小为368bp或480bp。名称片段大小PRV-gE-FTTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG368bpPRV-gE-RTTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCAPRV-gB-FAGGTGTCGTTGGTGGTGT480bpPRV-gB-RACGGCGACCTGGACG实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测鉴于PRV的检测需要区分野毒感染还是疫苗免疫，以纯化的DNA为模版，利用特异性引物分别进PCR（引物序列参见表2，gE引物用于鉴别野毒，gB引物用于常规检测）,qRT-PCR具体操作步骤参照附录B。9表2.荧光定量PCR引物信息9名称片段大小qPRV-gE-FCTGTACGTGCTCGTGATGACqPRV-gE-RCTCCTTGRTGACCGTGACGqPRV-gB-FGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATqPRV-gB-RACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC野毒分离与检测：将判定为猪伪狂犬病阳性的脑，肺脏或淋巴结等病料借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5000rpm/min离心10min。收集上清借助0.22μm滤膜除菌后，接种至PK-15细胞中，同时添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素，设置空白对照组。37℃吸附后1h，换成3%FBSDMEM细胞培养液，放置培养箱3d～5d，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。数据处理分析：①将PCR产物借助1.0%核酸胶进行分析，参照DNA标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小分别368bp或480bp符合预期，且空白对照没有条带，将阳性片段克隆至pMD-18T载体，送生物公司测序，若测序的序列与NCBI公布的标准序列（参考附录C）同源性大于95%，则可以确诊为猪伪狂犬病毒感染阳性，否则判定为阴性。②qRT-PCR结果显示待检测样品Ct值大于35且无“S”型扩增曲线时判定为阴性，Ct值小于35且出现“S”型扩增曲线时判定为阳性。③若PK-15细胞出现CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取DNA，借助上述特异性引物，进行PCR或qRT-PCR检测和测序确定，若易感细胞未出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，若盲传后没有CPE出现，则判定为未分离到病毒。3.2.2鸡马立克氏病采集病料样品采集患病鸡的血液、淋巴组织、脾脏组织或肿瘤细胞或羽髓匀浆等，参考NY∕T541要求进行。PCR检测与电泳分析将待测病料样品借助试剂盒提取DNA作为模版，借助特异性引物（序列参见表3）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析,目的片段大小为434bp。qRT-PCR检测以纯化的DNA为模版，利用特异性引物分别进qRT-PCR检测（序列参见表3）,qRT-PCR具体操作步骤参照附录B。表3.引物信息名称片段大小MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTCT360bpMDV073-RGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCqMDV073-FGTTTCTCCAGATTCCACCTC213bpqMDV073-RTGCAACAATGCGTTCTTAT野毒分离与检测：将判定为鸡疱疹病毒2型阳性的病料组织借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5000rpm/min离心10min。收集上清借助0.22μm滤膜除菌后，接种至鸡胚胎纤维细胞（DF-1）中，同时添加1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素，设置空白对照组。37℃吸附后1h，换成3%FBSDMEM细胞培养液，放置培养箱3d～5d，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。数据处理分析①PCR产物借助1.0%核酸胶进行分析，参照DNA标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小分别434bp符合预期，且空白对照没有条带，将阳性片段克隆至pMD-18T载体，送生物公司测序，若测序的序列与NCBI公布的标准序列（参考附录C）同源性大于95%，则可以确诊为鸡疱疹病毒2型感染阳性，否则判定为阴性。②qRT-PCR结果显示待检测样品Ct值大于35且无“S”型扩增曲线时判定为阴性，Ct值小于35且出现“S”型扩增曲线时判定为鸡疱疹病毒2型感染阳性。并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取DNA，借助上述特异性引物，进行PCR或qRT-PCR检测和测序确定，若易感细胞未出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，若盲传后没有CPE出现，则判定为未分离到病毒。3.2.3牛传染性鼻气管炎病料样品采集采集鼻拭子，血液，流产胎儿肺脏，生殖道分泌物等病料，按NY∕T541要求进行。PCR检测将待测病料样品借助试剂盒提取DNA作为模版，借助特异性引物（序列参见表4）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析,目的片段大小为479bp。qRT-PCR检测以纯化的DNA为模版，利用特异性引物分别进qRT-PCR检测（序列参见表4）,qRT-PCR具体操作步骤参照附录B。4表4.引物信息4名称片段大小BoHV-1gB-FTACGACTCGTTCGCGCTCTCBoHV-1gB-RGGTACGTCTCCAAGCTGCCCqBoHV-1gB-FCTGGCACACGACGGACGATGqBoHV-1gB-FCGCCTCCACTTCTTCCACGATG野毒分离与检测：将判定为牛疱疹病毒1型阳性的组织病料借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5000rpm/min离心10min。取上清用0.22μm滤膜除菌后，接种至牛肾细胞（MDBK）中，同时加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素，设置空白对照组。37℃吸附后1h，换成3%FBSDMEM细胞培养液，放置培养箱3d～5d，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。数据处理分析①PCR产物借助1.0%核酸胶进行分析，参照DNA标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小为479bp，符合预期，且空白对照没有条带，将阳性片段克隆至pMD-18T载体，送生物公司测序，若测序的序列与NCBI公布的标准序列（参考附录C）同源性大于95%，则可以确诊为牛疱疹病毒1型感染阳性，否则判定为阴性。②qRT-PCR结果显示待检测样品Ct值大于35且无“S”型扩增曲线时判定为阴性，Ct值小于35且出现“S”型扩增曲线时判定为牛疱疹病毒1型感染阳性。③若MDBK细胞出现CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取DNA，借助上述特异性引物，进行PCR或qRT-PCR检测和测序确定，若易感细胞未出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，若盲传后没有CPE出现，则判定为未分离到病毒。3.2.4马鼻肺炎病料样品采集采集鼻拭子，血液，马或驴的流产胎盘，肺脏和脑等病料组织，按NY∕T541要求进行。PCR检测将待测病料样品借助试剂盒提取DNA作为模版，借助特异性引物（序列参见表5）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析,目的片段大小为792bp,482bp或316bp。表5.PCR名称片段大小EHV-1gB-FGAACCTCAGCCAACCCAEHV-1gB-RGCACTTTGCGGACGAACEHV-4gB-FTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAG482bpEHV-4gB-FCTTAATCGCATTTAGACCGAEHV-8gG-FTCAGACTGTCACTCGTGGGAEHV-8gG-RCCTGAAGGCCGTTTAACACAqRT-PCR检测：以纯化的DNA为模版，利用特异性引物分别进qRT-PCR检测（序列参见表6）,qRT-PCR具体操作步骤参照附录B。表6.qRT-PCR引物信息名称片段大小qEHV-1gB-FGCCATACGTCCCTGTCCGACAA302bpqEHV-1gB-RCCTCCACCTCCTCGACGATGCqEHV-4gB-FCGCAGAGGATGGAGACTTTTACAqEHV-4gB-FCATGACCGTGGGGGTTCAAqEHV-8gG-FGACGCGTAACGTTGGATGTGqEHV-8gG-RAATGTAACGTTTGCCCACGC野毒分离与检测：将判定为马疱疹病毒（EHV-1/4/8）阳性的组织病料借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5000rpm/min离心10min。取上清用0.22μm滤膜除菌后，接种至兔肾细胞（RK-13）中，同时加入1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素，设置空白对照组。37℃吸附后1h，换成3%FBSDMEM细胞培养液，放置培养箱3d～5d，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。数据处理分析：①PCR产物借助1.0%核酸胶进行分析，参照DNA标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小为792bp,482bp或316bp，符合预期，且空白对照没有条带，将阳性片段克隆至pMD-18T载体，送生物公司测序，若测序的序列与NCBI公布的标准序列（参考附录C）同源性大于95%，则可以确诊为EHV-1，EHV-4或EHV-8感染阳性，否则判定为阴性。②qRT-PCR结果显示待检测样品Ct值大于35且无“S”型扩增曲线时判定为阴性，Ct值小于35且出现“S”型扩增曲线时判定为马疱疹病毒1型，马疱疹病毒4型或马疱疹病毒8型感染阳性。并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取DNA，借助上述特异性引物，进行PCR或qRT-PCR检测和测序确定，若易感细胞未出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，若盲传后没有CPE出现，则判定为未分离到病毒。3.2.5综合判定若患病动物（猪，鸡，牛，马或驴）出现呼吸困难，流产和神经症状等，则可判定为疑似α疱疹病毒感染，需借助PCR，荧光定量PCR进行检测，最后结合病原分离和测序等方法进行确诊。（三）确定依据本标准成员主要针对猪伪狂犬病病毒（PRV），鸡疱疹病毒2型（GaHV-2），牛疱疹病毒1型（BoHV-1）以及马疱疹病毒1型，4型或8型（EHV-1/4/8）等α疱疹病毒诊断开展系统的研究。1.病毒的基因组和复制特点PRV，GaHV-2，BoHV-1，和EHV-1/4/8同属于α疱毒亚科，是该病毒属中基因组最短的病毒亚科。基因组大小在125kb左右。主要特点是宿主范围广，病毒复制周期短，增殖速度较快，易诱发细胞病变，并在周围神经系统潜伏感2.流行特点和致病性PRV）引起猪的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，患病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。本病最主要的传播途径为空气传播，另外，在猪群中也存在鼻分泌物传播为狂犬病毒的现象。该病流行具有季节性，常发生在寒冷的季节。该病主要导致发热及脑脊髓炎，成年猪表现为一种亚临诊感染；妊娠母猪可见流产、死胎；育肥猪可见呼吸困难；仔猪以神经症状为主。Alphaherpesvirus2，GaHV-2）引起鸡的一种淋巴组织增生性疾病。病鸡和带毒鸡是传染来源，本病主要通过空气传播，另外污染的饲料和饮水，以及饲养人员流动也可传播带毒。本病主要是2-5月龄鸡常发。该病主要导致鸡外周神经、内脏器官、肛膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并发展成淋巴瘤。从而造成鸡肢体麻痹、不食、拉稀、脱水、贫血等症状。2.3牛传染性鼻气管炎：该病由牛疱疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，BoHV-1）引起牛的一种接触性传染病。病牛和带毒牛是主要传染源，病毒主要存在于鼻、眼、阴道分泌物和排泄物中。本病主要由飞沫经呼吸道传播，另外可通过生殖道黏膜、眼结膜传播。该病常发于秋、冬寒冷季节。该病导致牛出现呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等症状，还可引起生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎、流产、乳房炎等多种病型。herpesvirustype,EHV-1/4/8）感染引起的一种急性、热性传染病。该病的主要传染源是病马或驴和恢复后的带毒马或驴,病毒可存在于患病动物的血液、鼻液及流产的胎膜和胎儿组织中,部分公马或驴的精液中也可带毒。本病主要经呼吸道传染，另外，消化道及交配也可传染。该病多发生于秋冬和早春。该病主要导致马属动物出现呼吸道症状，孕马或驴流产，神经症状等。3.前期相关试验数据本标准通过比对GenBank公布的PRV，GaHV-2，BoHV-1，和EHV-1/4/8等多株。发现PRV的gE和gB蛋白基因序列相对保守，而且临床上主要应用PRV-gE基因缺失疫苗，该疫苗免疫虽能阻止临床发病,但难以完全阻止野毒感染。序列比对发现GaHV-2的MDV073基因比较保守。和EHV-8的保守区域设定特异性PCR引物（详见表1）和qPCR引物（详见表2）。TTTGAATTCTTACGACACGATTTGATTCAGATTTTGTTACAAGTTCAAGGCCCACATC为了验证本标准检测引物的有效性，我们分别借助普通PCR引物分别现存的病毒进行检测和规模化畜禽养殖场采集的待测血样进行检测。结果如下：3.1PRV检测引物有效性测试，临床样本检测，病原分离与①PRVgE引物浓度筛选图1.PCR扩增及引物浓度筛选.1-5：引物浓度分别为10.0μM、5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、6：阴性对照②PRVDNA倍比稀释PRVgE引物用10.0μM，对提取病配置相同PCR体系，不同稀释度模板体积等量）。图2.引物PCR的敏感性试验结果.1-5：DNA浓度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：阴性对照③PRVgB引物浓度筛选图3.PCR扩增及引物浓度筛选.1-5：引物浓度分别为10.0μM、5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、6：阴性对照④PRVDNA倍比稀释PRVgB引物用10.0μM，对提取病配置相同PCR体系，不同稀释度模板体积等量）。图4.引物PCR的敏感性试验结果.1-5：DNA浓度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：阴性对照。⑤猪场临床血液样品检测借助DNA提取试剂盒获取将收集血液样品的DNA，以此为模板进行PCR检测。图5.临床血样检测，1为阴性对照，2-9为待测猪血样⑥临床血液样品测序比对图6.MDV测序比对结果⑦野毒分离和鉴定易感细胞MDBK出现CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落（图7）。进一步收取细胞提取DNA，借助特异性引物进行PCR检测。图7.PRV野毒分离与PCR鉴定⑧实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测图8.gE基因qPCR检测图9.gB基因qPCR检测3.2GaHV-2检测引物有效性测试，临床样本检测，病原分离与鉴定①GaHV-2MDV073引物浓度筛选②GaHV-2DNA倍比稀释GaHV-2MDV073引物用10.0μM，对提取病毒DNA模板进行10倍数稀释10-1，10-2,10-3,-4-5，配置相同PCR体系，不同稀释度模板体积图11.GaHV-2引物PCR的敏感性试验结果.1-5：DNA浓度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：阴性对照。③鸡场临床血液样品检测：将待测血样分别借助DNA提取试剂盒获取将收集血液样品的DNA，以此为模板进行PCR检测。图12.PCR扩增检测临床部分临床血样，1为阴性对照，2-20为血清样品。④临床血液样品测序比对:选取PCR阳性的样品，将其克隆至pMD18-T载体送华大基因测序。图13.序列比对分析⑤野毒分离和鉴定将组织病料粉碎过滤后，接种DF-1细胞，48h后，观察细胞结果如图15所示。分别收取细胞样品提取DNA进行PCR检测。图14.鸡疱疹野毒2型分离与PCR鉴定⑥实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测15.鸡疱疹野毒2型MDV073基因qPCR检测3.3BoHV-1检测引物有效性测试，临床样本检测，病原分离与鉴定①BoHV-1gB引物浓度筛选M、0.625μM；6：阴性对照配置相同PCR体系，不同稀释度模板体积等量）。图17.BoHV-1引物PCR的敏感性试验结果.1-5：DNA浓度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,6：阴性对照。③牛场临床血液样品检测将待测血样分别借助DNA提取试剂盒获取将收集血液样品的DNA，以此为模板进行PCR检测。图18.PCR扩增检测临床部分临床血样，1为阴性对照，2-20为血清样品。④临床血液样品测序比对选取PCR阳性的样品，将其克隆至pMD18-T载体送华大基因测序。图19.序列比对分析⑤野毒分离和鉴定将组织病料粉碎过滤后，接种MDBK细胞，48h后，观察细胞结果如图20所示。分别收取细胞样品提取DNA进行PCR检测。图20.牛疱疹1型野毒分离与PCR鉴定⑥实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测图21.BoHV-1gB基因qPCR检测3.3EHV-1/EHV-4/EHV-8检测引物有效性测试，临床样本检测，病原分离与鉴定①EHV-1/EHV-4/EHV-8引物浓度筛选②EHV-1/EHV-4/EHV-8DNA倍比稀释相应的引物为10.0-4，10-5，配置相同PCR体系，不同稀释度模板体积等量。-2,-3,-4,-5,③EHV-1/EHV-4/EHV-8临床血液样品检测将待测血样分别借助DNA提取试剂盒获取将收集血液样品的DNA，以此为模板进行PCR检测。④测序分析选取PCR阳性的样品，将其克隆至pMD18-T载体送华大基因测序。⑤野毒分离与鉴定将组织病料粉碎过滤后，接种RK-13细胞，48h后，观察细胞结果如图26所示。分别收取细胞样品提取DNA，借助不同病原引物进行PCR检测。⑥EHV-1/EHV-4/EHV-8实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检图27.EHV-1/EHV-4/EHV-8的qPCR检测本标准制定的疱疹病毒诊断方法涵盖普通PCR和荧光定上述实验数据证实本标准提供的PCR和定量PCR检测引物和方法具有良好的敏感性、特异性、以及操作简便等优点，等病原的早期检测、流行病学调查等提供一种有效的规范参EHV-1/EHV-4/EHV-8野毒分离的方法，为病原的检测和溯源分析奠定基础。4.第三方检测机构验证结论本标准涉及检测内容分别由山东省农业科学院家禽研究所检测中心，山东润达检测技术有限公司，和冠县冠康动物检测服务有限公司等3家检测机构进行检测验证。检测结果均与《动物疫病诊断技术第2部分：α疱疹病毒》编制说明提供的实验数据保持一致（详细内容参见附件）。三、制定本标准的主要依据GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18641伪狂犬病诊断方法GB/T18643鸡马立克氏病诊断技术GB/T16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T27621马鼻肺炎病毒的PCR检测方法NY∕T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T575牛传染性鼻气管炎诊断技术本标准编制团队成员参考上述相应的诊断技术等研究成果，并结合我省规模化猪、鸡、牛、马或驴养殖场α疱疹病毒发病和流行情况。同时走访山东省不同地区的规模化养殖场，调查当地猪，鸡，牛，马以及驴的疾病发生情况，采集血样、鼻拭子以及流产病料等进行流行病学调查，分别分株α疱疹病毒野毒，经过了规模化畜禽养殖企业的回归实践检验。汇总分析试验研究，充分考虑我省规模化畜禽养殖场主要疫病的发生情况，力求达到标准内容符合实际、可操作性强。编制标准所依据的参考文献主要是最近5年来在《VirologicaSinica》、《JournalofVeterinaryScience》、《JVirolMethods》、《动物医学进展》以及《新疆农业大学》等国内外该领域顶尖期刊上发表的有关研究论文和成果，代表了针对伪狂犬病，鸡马立克氏病，牛传染性鼻气管炎，马鼻肺炎的最新进展，充分体现了动物疱疹病毒诊断制定的科学性、必要性和合理性。四、与现行相关法律、行政法规和其他标准的关系本标准是以《中华人民共和国畜牧法》、《中华人民共和国动物防疫法》等为基础，参考《GB/T18641伪狂犬病诊断18643鸡马立克氏病诊断技术》,《GB/T16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程》和《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发[2017]25号）等标准而制定，与现行有关法律、法规和国家、行业标准无抵触关系。国内外均未见相关法律、法规及行业标准。五、重大分歧意见的处理过程、处理意见及其依据本标准无重大分歧意见六、对地方标准自发布日期至实施日期之间的过渡期的建议及理由本标准发布后，为了有效贯彻实施之，建议有关部门加强实施推广，使相关人员充分了解标准的各项条款，改变目前我省畜禽养殖场α疱疹病毒诊断与防控过程中各个环节存在的无标可依的现状。七、其他需要说明的内容提出部门（盖章）参考文献：[1].WernikeK,BeerM,FreulingCM,KluppB,MettenleiterTC,MüllerT,etal.Moleculardouble-checkstrategyfortheidentificationandcharacterizationofSuidherpesvirus1.JVirolMethods.2014;209:110-5.[2].RenQ,RenH,GuJ,WangJ,JiangL,GaoS.TheEpidemiologicalAnalysisofPseudorabiesVirusandPathogenicityoftheVariantStraininShandongProvince.FrontVetSci.2022;9:806824.[3].MaZ,HanZ,LiuZ,MengF,WangH,CaoL,etal