HYT 0347-2022 海水中痕量铵盐的测定 流动分析-邻苯二甲醛固相萃取-荧光光度法（正式版）

中华人民共和国海洋行业标准海水中痕量铵盐的测定流动分析-邻苯二甲醛固相萃取-荧光光度法Determinationofseawatert中华人民共和国自然资源部发布HY/T0347—2022 I 12规范性引用文件 13术语和定义 4方法原理 5干扰和消除 26试剂与材料 27仪器和设备 38样品采集与保存 49分析步骤 410结果计算与记录 11精密度和准确度 612质量保证和质量控制 613注意事项 6附录A(资料性)海水中痕量铵盐的测定分析记录 8附录B(规范性)海水中痕量铵盐测定的质量控制要求 9参考文献 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国自然资源部提出。本文件由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本文件起草单位：自然资源部第三海洋研究所、自然资源部第二海洋研究所、厦门大学。1海水中痕量铵盐的测定流动分析-邻苯二甲醛固相萃取-荧光光度法本文件描述了采用流动分析-邻苯二甲醛固相萃取-荧光光度法测定海水中痕量铵盐的方法原理、分析步骤和结果计算与记录，规定了干扰和消除、试剂与材料、仪器和设备、本文件适用于海水中纳摩尔每升(nmol/L)级别痕量铵盐的测定。样品富集体积为10mL时，本方法的检出限为9nmol/L,测定下限为15nmol/L。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于GB/T12763.4海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查GB17378.2海洋监测规范第2部分：数据处理与分析质量控制3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理4.1流动分析系统工作原理样品与试剂在蠕动泵的推动下进入分析模块，在密闭的管道中按设定的顺序和比例进行混合、反在碱性介质中，海水样品中的铵盐与邻苯二甲醛、亚硫酸盐发生衍生化反应，生成具有荧光性质的异吲哚衍生物，该衍生物富集在固相萃取小柱上，经乙醇洗脱后，用荧光检测器在365nm激发波长、425nm发射波长下测定。参考分析流路图见图1。2标引符号说明：P₁——蠕动泵1;R₂——亚硫酸钠溶液(见6.12);P₂——蠕动泵2;V₁——六通阀1;R₃——四硼酸钠缓冲溶液(见6.13);C₁——混合盘管1,80cm;V₂——六通阀2;R₄——洗脱液(见6.14);C₂——混合盘管2,80cm;V₃——多位选择阀；R₅——超纯水；C₃——混合盘管3,80cm;D——荧光检测器；S——样品；L——10mL定量环；R₁——邻苯二甲醛溶液(见6.11);W——废液。E——固相萃取小柱(见6.22);图1流动分析-邻苯二甲醛固相萃取-荧光光度法测定痕量铵盐的分析流路图5干扰和消除为防止空气中的氨气及颗粒物对试剂的干扰和污染，需增加试剂保护柱，试剂保护柱由一次性注射器改装而成。去除5mL一次性注射器的活塞和针头，在空筒内填充3mL酸化硅胶(见6.21),即制成试剂保护柱。在试剂瓶瓶盖上打孔，其大小以能够套紧注射器空筒的乳头为宜；将乳头即整支试剂保护柱固定在试剂瓶瓶盖上。6试剂与材料除非另有说明，在分析中均使用确认为分析纯的化学试剂，实验用水均为新制备的超纯水(电阻率大于或等于18.0MΩ·cm)。6.3无水亚硫酸钠(Na₂SO₃)。6.5十水合四硼酸钠(Na₂B₄O₇·10H₂O)。6.695%(体积分数)乙醇(C₂H₅OH)。36.9氯化铵(NH₄Cl):优级纯，在100℃±5℃下烘干并恒重后，保存在干燥器中。6.10硅胶(200目)。6.11邻苯二甲醛溶液：c(C₈H₆O₂)=3mmol/L。配制方法为：称取3.35g邻苯二甲醛(见6.1)溶于200mL甲醇(见6.2)中，用水稀释至1L,得到邻苯二甲醛溶液浓度为25mmol/L。该溶液贮存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可稳定1个月。临用时用水稀释至3mmol/L。6.12亚硫酸钠溶液：c(Na₂SO₃)=0.8mmol/L。配制方法为：称取1.26g无水亚硫酸钠(见6.3)溶于水中，并定容至1L,加入0.2mL甲醛(见6.4),得到亚硫酸钠溶液浓度为10mmol/L。该溶液贮存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可稳定1个月。临用时用水稀释至0.8mmol/L。6.13四硼酸钠缓冲溶液：p(Na₂B₁O₇)=15g/L。配制方法为：称取15g十水合四硼酸钠(见6.5)溶于水中，并定容至1L。该溶液贮存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可稳定1个月。6.14洗脱液：95%(体积分数)乙醇(见6.6),使用前用超声波脱气10min。6.15硫酸溶液：c(H₂SO₄)=6mol/L。配制方法为：量取300mL硫酸(见6.7),在不断搅拌下缓缓加入600mL水中。6.16盐酸溶液：c(HCl)=1mol/L。配制方法为：量取50mL盐酸(见6.8)与550mL水混合均匀。6.17铵盐标准贮备液：c(NH₄Cl)=10.00mmol/L。配制方法为：准确称取0.3304g氯化铵(见6.9)溶于水中，并定容至500mL,贮存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可稳定1个月。6.18铵盐标准中间溶液：c(NH₄Cl)=100.00μmol/L。配制方法为：准确量取1.00mL铵盐标准贮备液(见6.17),用水定容至100mL,贮存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可稳定7d。6.19铵盐标准使用溶液：c(NH₄Cl)=1.00μmol/L。配制方法为：准确量取液(见6.18),用水定容至100mL,现用现配。6.20低铵海水：取采集于寡营养盐海域的海水作为低铵海水，常温密封保存，其铵盐浓度应低于本方法的检出限。6.21酸化硅胶。配制方法为：称取200g硅胶(见6.10)在70℃下烘干过夜，加入50mL硫酸溶液(见6.22固相萃取小柱(OasisHLB小柱):6cm³/200mg。6.23蠕动泵泵管。试剂泵管内径0.89mm,样品泵管内径2.06mm。6.24聚四氟乙烯管。流路管道和混合盘管内径0.75mm,进样管和反应盘管内径1.5mm。7仪器和设备7.1商品化或实验室自制的流动分析装置，参见图1,主要由下列各部分组成：——蠕动泵；——多位选择阀；——六通阀；——流动分析用荧光检测器；——数据处理及仪器控制软件。7.2恒温水浴装置。7.3分析天平：感量为0.0001g。7.5一般化学实验室常用的仪器和设备。48样品采集与保存样品采集与保存措施如下：a)采样前，应依次用盐酸溶液(见6.16)、超纯水清洗所有接触样品的器皿；b)采样过程注意防止污染，应戴无营养盐污染的一次性手套，每采一次样品应更换手套；c)先用样品将高密度聚乙烯瓶润洗3次以上，再将样品采集于瓶中；d)采集的样品一般无需过滤，如果必须过滤，要特别注意防止过滤过程中引入污染；e)样品采集后宜现场分析，若无法及时分析，可置于冰箱中冷藏或在一20℃下速冻保存，冷藏不能超过24h,冷冻不宜超过5d。9分析步骤9.1仪器调试按照图1所示连接分析系统。开机后，先用超纯水代替试剂，检查整个分析流路的密闭性及液体流动的顺畅性，然后依次使用超纯水、盐酸溶液(见6.16)、超纯水清洗整个管路各20min,待基线稳定后，将各管道的入口端置入对应的试剂或样品中。9.2仪器运行程序设定按表1设定运行程序和参数，分析流路参见图1,具体步骤如下：a)步骤1,样品与试剂R₁(邻苯二甲醛溶液)、R₂(亚硫酸钠溶液)、R₃(四硼酸钠缓冲溶液)在P₁(蠕动泵1)的推动下，在流路中混合并进入定量环；b)步骤2,定量环中样品与试剂在恒温水浴装置中(温度65℃±1℃)停流反应一定时间，生成异c)步骤3,超纯水在P₂(蠕动泵2)作用下将定量环中的衍生反应溶液推送进入固相萃取小柱，衍生物被萃取；d)步骤4,在继续步骤3操作的同时，洗脱液清洗检测器流通池；e)步骤5,固相萃取小柱上富集的衍生物被洗脱液迅速洗脱，流经荧光检测器进行检测；超纯水同时清洗定量环及反应流路。表1分析系统的运行程序和参数P₂流速“多位选择阀阀位持续时间S说明11.7(试剂)8.3(样品)5.0(超纯水)接多位阀的通道)2样品与试剂R₁(邻苯二甲醛溶液)、R₂(亚硫酸钠溶液)、R₃(四硼酸钠缓冲溶液)混合后，充满定量环；超纯水清洗检测22300或5表1分析系统的运行程序和参数(续)P₁流速“多位选择阀阀位持续时间S说明35.0(超纯水)接多位阀的通道)2小柱上富集45.0(超纯水)5.7(洗脱液)1小柱上富集；洗脱液清洗检测54.3(超纯水)4.6(洗脱液)1生物，送入检测器检测b选择标准系列I绘制标准曲线时，时间设置为300s;选择标准系列Ⅱ绘制标准曲线时，时间设置为200s。溶液(见6.19),用低铵海水(见6.20)稀释并定容至100mL,制备6个浓度点的标准系列。铵盐的浓度的铵盐标准使用溶液(见6.19),用低铵海水(见6.20)稀释并定容至100mL,制备7个浓度点的标准系行计算。测定分析记录表参见附录A。6c——样品中铵盐的浓度，单位为纳摩尔每升(nmol/L);y——测定的荧光信号值(荧光强度);b——标准曲线拟合方程的截距；a——标准曲线拟合方程的斜率。计算结果表示到小数点后一位。11精密度和准确度11.1精密度6家～7家实验室分别使用本方法对铵盐浓度为40.0nmol/L、150.0nmo/L的样品进行了重复测试(n=9～11),测定平均值分别为33.3nmol/L～45.8nmol/L和146.3nmol/L～162.4nmol/L;重复性标准差分别为1.7nmol/L和5.2nmol/L;重复性限分别为4.7nmol/L和14.7nmol/L;再现性标准差分别为4.9nmol/L和7.7nmol/L;再现性限分别为13.7nmol/L和21.4nmol/L。在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值应不大于这两个测定值的算术平均值的20%,以大于20%的情况不超过5%为前提。在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值应不大于这两个测定值的算术平均值的35%,以大于35%的情况不超过5%为前提。取适量浓度为6.00μmol/L的铵盐国家一级标准物质，用低铵海水稀释后作为样品(稀释后浓度分别为40nmol/L和150nmol/L),由7家实验室分别使用本方法进行测试，结果的相对偏差范围为-7.9%～2.9%。7家实验室分别对实际海水样品进行加标回收测定，加标浓度为25.0nmol/L~50.0nmol/L,回收率范围为93.6%～103.3%。12质量保证和质量控制质量保证和质量控制应按照GB17378.2和GB/T12763.4的规定执行。每批样品或连续测定8h后应做一个全程方法空白样件的加带一个标准参考物质样品。全程方法空白样以低铵海水替代样品，测定步骤同样品。测定结果应符合附录B的规定。建议每分析10个样品，使用标准曲线中间浓度溶液进行校准核查。如果测定值与理论值的相对误差在±10%之内，说明测定系统在可控范围内。如果相对误差超过±10%,说明测定系统失控，则应检查仪器、试剂溶液是否正常，确定无疑后重新配制、测定、绘制标准曲