基因工程知识点

1.基因操作与基因工程的关系

基因操作：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因工程：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当

的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体

生物性状或获得表达产物。

基因操作的核心是基因重组技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。

基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。

2.基因工程的理论基础

1生物界的不同基因之间具有相同的物质基础

所有基因均是(或可转化为)具有特定核甘酸序列和遗传功能的DNA片段，因此所有基因均可

以DNA片段作为材料进行加工或工程处理。

2所有生物享有相同的遗传密码规则

所有生物都由一个共同的祖先沿不同的分支进化而来，但他们都遵循中心法则(central

dogma),遗传编码规则没有改变。

3基因作为DNA片段，可在体外进行人工裁剪、修饰和连接

有许多类型的工具酶可以完成这些操作：

4基因作为DNA片段，可以通过转基因技术实现从任一生物向目标生物的转化

基因操作中，基因可通过质粒或病毒载体或不需要载体，导入目标生物，现在外源DNA的

转化或转染已经比较成熟。

5转基因遵循同内源基因一样的遗传规律，可通过DNA复制将其遗传信息传递给子代

基因工程的外源基因可整合进目标生物的基因组中稳定遗传。DNA的半保留复制模式是高

保真的。

6转基因遵循同内源基因一样的表达规则，其表达可赋予特定的生物学功能

基因工程的技术基础：

(1).DNA体外切割和连接技术(限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA

重组时代的开始)。

(2).克隆载体的发展与应用。

(3).大肠杆菌转化体系的建立。

(4).琼脂糖电泳技术的应用。

(5).DNA测序技术的应用。

(6).核酸杂交技术的应用。

从技术上为基因工程的诞生奠定了基础。

基因及其产物的共线性：一个基因的核甘酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应。

N个氨基酸=3N个编码碱基。

内含子(intron)是指真核基因在RNA加工过程中从原初转录本中剪去而不进入成熟RNA

结构、不具有氨基酸编码能力的一段序列。

外显子(exon)：是真核基因转录本中剪去内含子后所保留的RNA片段，它们拼接并进行适

当修饰后成为成熟RNA并执行相应功能。

基因的重叠性：单个DNA序列可编码一个以上的蛋白质，它们在结构上可以具有序列重复

性，也可以是相互完全不同的全新蛋白质。

开放读码框(openreadingframe.ORF)：成熟mRNA中从起始密码子ATG至终止密码子(TAA、

TAG或TGA之一)之间形成的一个连续的氨基酸编码区间。

转录单位(transcriptionunit)/转录本(transcript)：从转录起始位点直至转录的最后一个碱

基之间被转录的RNA序列，可以包含一或多个蛋白编码框。

启动子(promoter)：基因转录过程中控制起始的部位，通常是位于转录起始位点5,上游的

一段DNA区间，其上有许多顺式元件。

转录起始位点(transcriptionstartsite)：起始转录的第一个碱基，也是掺入到RNA中的第1

个碱基。在转录研究中记为+1,其5,方向的第1个碱基(已属于启动子而非转录区)为-1。

侧翼序列(flankingsequence)：一条核酸单链上位于某一特定位置的5'或3'方向的序列。

终止子(terminator)：位于基因的3'部位、终止基因转录过程的一段DNA区间。有依赖不

依赖P因子两种。

核糖体结合位点(ribosomalbindingsite,RBS)：位于mRNA起始密码子及其正上游的一段区

间，是核糖体结合并起始翻译过程的位点。原核和真核的RBS显著不同。

一、基因是基因重组的物质基础

遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。

基因(gene)是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，

也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA,可以存在于染色体上，也可存在于染色体

之外(如质粒、噬菌体等)。

亚克隆(subcloning)：

1、将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段,然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究。

初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达序

列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个

过程叫"亚克隆"。

2、通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。

亚克隆技术：泛指实验室中以DNA在大肠杆菌中经典克隆操作为核心的基本技术体系。

三、II限制酶的功能和产生的末端类型

H限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二

酯键，产生的DNA片段5'端为P,3'端为0H,识别序列一般为4〜6个碱基对，通常是

反向重复顺序，具有180°的旋转对称性，即回文结构。

II限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型。

1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5,突出和3,突出的粘性末端(cohesive/sticky

end)两种。

2、平末端(bluntend)：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100

倍左右。

3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性

末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。

同裂酶：不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序

异切酶、同功多位酶和其它类型。

同尾酶：不同限制酶识别序可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可

以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。

归位内切酶(homingendonuclease)：一些线粒体、叶绿体、核DNA和T偶数噬菌体的内含

子编码内切酶(称为l-prefix)或内含肽(intein)具有内切酶活性(称为Pl-prefix)。它们识

别序列很长，核心识别序列一般为10-12bp,识别位点极少。

DNA聚合酶(DNApolymerase)的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTPs

等情况下)及其相辅的活性。

真核生物有4种DNA聚合酶：a、B、丫、线粒体型。

原核生物有3种DNA聚合酶：I、II、HI型。

反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板聚合cDNA链，具有5'-3’的DNA

聚合酶活性、5'-3'的RNA外切核酸酶活性和RNaseH活性，但缺乏3'-5'RNA外切

核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。

基因工程载体必须具备的条件：

(1)有复制起点

(2)具有若干个限制性内切酶的单一识别位点

(3)具备合适的筛选标记

(4)具备合适的拷贝数目

(5)分子量要相对较小

(6)在细胞内稳定性要高

(7)易分离纯化

a-互补(acomplementation)：人工突变使大肠杆菌的半乳糖普醐基因(/acZ)缺:失N-端的第

11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(/ac7),二者单

独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的

LacZ酶。

多克隆位点(multiplecloningsite)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多

个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。

插入失活(insretionalinactivation)：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编

码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。

蓝白斑筛选(white-bluescreening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于a-互补而形成的

功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色

(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于/ocN基因的插入失活而不能形成a-互补，在IPTG+X-gal

条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑)；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出

重组子与非重组子的目的。

几种载体的最大装载量：质粒W15kb,入-DNA425kb,考斯质粒W45kb,BAC<300kb,

YAC<1000kbo

穿梭载体(shuttlevector)：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，

它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。

只要涉及大肠杆菌以外的细胞，绝大多数载体都装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看

作穿梭载体。

整合载体(integrationvector)：用于将某个基因或某些基因插入到宿主的染色体中去工作，按

整合方式可分为定点整合和随机整合两类，按作用可分为目的基因的插入/敲除或随机突变

体库的构建。

碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两

条互补链不会完全分离。

当以PH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保

存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不

稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

提取过程中所用的材料:LB培养基、

葡萄糖/Tris/EDTA溶液(50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris,HCI；pH8.0,10mmol/LEDTA)^

TE缓冲液、3moi/L乙酸钾溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙

醇等。

①溶菌酶:溶菌酶是糖甘水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的B-1,4糖昔键,

因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca?+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，同时有利

于溶菌酶的作用。

②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使

染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS使蛋白质变性沉淀下来。

③KAc:pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复

性，并能稳定存在。

④无水乙醇:沉淀DNA,它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醉与核酸不会起任何化

学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺

去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白

质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。

⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于

分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度

与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平

的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较

昂贵。

衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD26o/OD28o对DNA而言其值大约为1.8。

■当OD26O/C)D28O大于1.8则可能有RNA污染。

■当OD260/OD280小于1.8时则有蛋白质污染。

■双链DNA的OD260为1时相当于浓度为50Ug/mL。

■单链DNA的OD260为1时相当于浓度为40ug/mL。

■寡核酸的OD260为1时相当于浓度为20-40ug/mL。

一、PCR的基本原理

■首先待扩增DNA团模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度

可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得

以延伸。回这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下

的这种循环的不断重复。

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR

扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55c左右，引

物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在7dqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料,

靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。

二、PCR反应体系

1缓冲液

10mmol/LTris-HCL50mmol/LKCI,pH=839Q（室温时约为7.2）,还可能有添加剂、共溶

剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

厂商一般以25mmolMgC『+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。

Mg?+浓度过低会使hq防活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

Mg?+可与负离子结合,所以反应体系中dNTPs,EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

2、脱氧三磷酸核甘（dNTPs）

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。

3、引物

一般溶成10pmol/L的贮存液，使用浓度为0.1-0.5|jmol/L„

浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。

4、模板

单、双链DNA均可。

一个PCR反应中IO4至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的

模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。

不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是

限制PCR扩增的重要因素。

不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母DNA、细菌DNA、

质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为卬g、10ng.Ing,lpg和1%噬菌斑。

模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

5、耐热性的DNA聚合酶

有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5,f3,聚合酶和5，玲3,外切酶

活性，但在3'35'外切酶活性（proofreading,校正功能，决定保真度,fidelity）、耐热性和附加

功能上有差异。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影

响产量。

也DNA聚合酶：来自激烈热球菌（Pyrococcus/ariosus）,具有极高的热稳定性，目前公认是

最保真的。

二、TA克隆

Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3,末

端加上一个突出的A»

T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3,末端

具有一个突出的T,如promega公司的pGEMT-easy。

TA克隆：将3,末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定

为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功

能研究等。

PCR-TOPO技术：T载体上已经偶连有拓扑异构酶，因此PCR产物无需DNA连接酶而可直接

与该T载体进行快速连接重组。

基因库（genepool）：特定生物体全基因组的集合（天然存在）

基因文库（genelibrary）：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人

工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：

基因组文库：材料来自染色体DNA,含有全部基因组序列。

任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用

该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。

cDNA文库：材料来自mRNA,含有全部蛋白编码基因的cDNA,无启动子、终止子、内含

子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。

探针（probe）：用于通过分子杂交，分离并获得目标基因克隆子的核酸片段。

探针来源：基因本身的部分序列、异源物种的同源基因序列、蛋白氨基酸序列反翻译推导的

核甘酸序列、分子标记。

基因工程的根本技术是DNA重组技术。

3植物基因工程的性状和基因

l）8t基因：编码杀虫晶体蛋白，杀死鳞翅目

2）P/基因：编码蛋白酶抑制剂，对许多昆虫具有广谱抗性

3）凝集素（Lee雨）基因：来自于各种植物，编码凝集素，主要用于防治同翅目（Homoptera）

害虫如蜘虫、飞虱等。有的凝集素对人畜有毒，但目前使用的雪花莲凝集素GNA等被证明

是安全的。

4）84基因：来自于植物，编码a-淀粉酶抑制剂，可防治鞘翅目（Co/eoptera）害虫，但许

多也能抑制哺乳动物的a-淀粉酶。

5）其它基因：如几丁质酶、蝎毒素（scorpiontoxin）、苦楝素（azedarachin）、鱼藤酮（rotenone）

等基因，有的有前景，有的则存在安全性问题。

3.2抗病基因

1）抗病毒病2）抗真菌病3）抗细菌病4）抗线虫病：

3.3耐非生物性胁迫的基因

1）耐高温干旱2）耐冷耐冻3）耐盐4）耐缺素5）耐土壤毒害6）耐氧化还原电位胁迫

3.