(高清版)GBT 40265-2021 酶免疫检测抗体检测通则

GB/T40265—2021酶免疫检测抗体检测通则国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40265—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。1GB/T40265—2021酶免疫检测抗体检测通则1范围本文件规定了酶免疫检测抗体检测的一般要求、检测过程和结果表述。本文件适用于酶免疫检测用抗体的检测控制。本文件不适用于具有标记物的酶免疫检测用抗体的检测控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T25915.1洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。抗体antibody免疫球蛋白immunoglobulin机体免疫系统在抗原刺激下，由B细胞增殖分化为浆细胞后产生的一类能与相应抗原特异性结合并介导产生体液免疫效应的球蛋白。抗原antigen可以诱导生物体产生抗体的物质，能够被相应抗体识别并与之结合。用于免疫制备抗体的动物物种或抗体恒定区的氨基酸序列与待分析抗体最相近的动物物种。抗体类型antibodyisotype根据抗体的结构和免疫原性不同，对抗体的分类。和λ两类。抗体重链的种类决定了抗体类型，哺乳动物体某种抗体识别特异性抗原所需的最低浓度。注：抗体效价通常使用检测结果呈阳性时抗体的最高稀释度表示。2GB/T40265—20213.6样品中目标抗体含量占总蛋白含量的百分率。3.7亲和力affinity抗体与抗原间的结合强度的综合评价指标。注：包括单克隆抗体亲和力与多克隆抗体亲和力。通常用解离常数Kp表示。Kp数值越低表示抗体亲和力越好。3.8交叉反应crossreaction抗体与目标分析物的结构类似物也能产生反应的现象。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DMSO:二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide)HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)IgA:免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA)IgD:免疫球蛋白D(ImmunoglobulinD)IgE:免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE)IgG:免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)IgM:免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM)IgY:免疫球蛋白Y(ImmunoglobulinY)TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)5一般要求5.1检测样品5.1.1检测样品宜具备说明书或同功能资料。5.1.2应在洁净环境下，使用洁净、干燥器具取样。样品应具有代表性。蛋白抗原、抗体等不稳定的样品，宜在低于8℃的低温下尽快完成取样，并于低温保存待用。5.2.1生物安全部分应符合GB19489中的相应要求。5.2.2洁净区的悬浮粒子浓度应符合GB/T25915.1规定的ISO6级的要求。5.2.3在处理废弃样品、试剂和容器之前，应保证试验操作人员和周围环境的安全。为了降低污染物5.3试剂材料5.3.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为生化试剂或更高级别试剂，水为GB/T6682规定的一级水。GB/T40265—20215.3.2使用的玻璃器具应为一级硬玻璃或经过钝化处理。5.3.3使用的合成树脂器具应为聚丙烯或其他低吸附材料制作，不添加染料、填充物。5.3.4使用的酶标板底部应具有亲水表面。5.4检测指标6检测过程6.1抗体种属来源宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量肽谱法等方法检测抗体的种属来源。若使用间接酶联免疫吸附法见附录A。6.2抗体类型宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量肽谱法等方法检测抗体类型。若使用间接酶联免疫吸附法见附录A。6.3抗体纯度宜使用液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法或毛细管电泳法等方法检测抗体的纯度。若使用高效液相色谱法见附录B。6.4抗体浓度测定法等方法检测抗体的浓度。若使用高效液相色谱法见附录C。宜使用间接酶联免疫吸附法或试管凝集试验等方法检测抗体的效价。若使用间接酶联免疫吸附法见附录D。6.6抗体亲和力宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测抗体与目标分析物的亲和力。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录E。6.7抗体交叉反应宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测抗体与目标分析物结构类似物的交叉反应。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录F。34GB/T40265—2021GB/T40265—2021(资料性)A.1原理该方法使用可以识别不同种属来源和抗体类型的特异性抗体检测待测抗体的种类。根据待检测抗体的种属来源和抗体类型选择合适的HRP标记的特异性抗体若干，用于鉴定的抗体宜至少包括：抗小绵羊IgG抗体、抗鸡IgY抗体。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。A.2试剂与材料A.2.1磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4):在800mL水中加入1.15g磷酸氢二钠，0.20g磷酸二氢钾，加水定容至1000mL。A.2.3封闭缓冲液：部分抗体可能与封闭液中的成分结合，影响检测结果。可根据实际情况选择以下A.2.4洗涤缓冲液：在1000mL磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4)中加入0.5mL吐温—20。A.2.5抗体稀释液：在100mL封闭缓冲液中加入0.05mL吐温—20,4℃保存。A.2.6TMB显色工作液：根据以下配方，按照1:1比例混合TMB显色液A与TMB显色液B即成，现配现用。(30%),溶解后，加水定容至500mL,4℃避光保存。A.2.7反应终止液：在800mL水中加入83.33mL浓盐酸，加水定容至1000mL。A.2.8HRP标记的特异性抗体。A.3.2清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入56GB/T40265—2021置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次～5次。或使用微孔板自动洗板机A.3.3封闭：每孔加入200μL封闭缓冲液，在37℃恒温培养箱中孵育90min。A.3.4清洗：重复步骤A.3.2。A.3.5待测抗体孵育：将待测抗体按1:1000比例稀释，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100μL稀释后的待测抗体样品。在37℃恒温培养箱中孵育60min。A.3.6清洗：重复步骤A.3.2。A.3.7特异性抗体孵育：根据说明书稀释各种HRP标记的识别不同种属来源和抗体类型的抗体，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100μL稀释后的抗体，每种二抗重复3次。每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的抗体稀释液，重复3次。在37℃恒温培养箱中孵育60min。TMB显色工作液。在37℃恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束后每孔立即加入100μL反应终止液。A.3.10测量：反应终止后30min内，在酶标仪上测量并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为450nm,参比波长为620nm。A.4结果分析A.4.1试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于0.2,且最大测量结果的吸光度大于或等于0.8时，A.4.2结果分析：按照式(A.1)计算针对不同种属来源和抗体类型的抗体的相对显色强度。…………(A.1)式中：Sx——针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的相对显色强度；ODx——针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的吸光度测量值；ODsc—-—阴性对照的吸光度测量值；ODmax——所有测量结果中的最大吸光度。当仅有一种特异性抗体的相对显色强度为1,且其他的相对显色强度均小于或等于0.4时，可以判定待测抗体的种属来源和抗体类型为相对显色强度为1的特异性抗体所识别的种属来源和抗体类型。否则，无法判断待测抗体的种属来源和抗体类型，如有需要，可通过抗体氨基酸测序和序列分析对抗体的种属来源和抗体类型进行判断。7GB/T40265—2021(资料性)抗体纯度检测高效液相色谱法B.1原理使用高效液相色谱法检测单克隆抗体的纯度时，可通过体积排阻或离子交换等不同原理对样品中的不同组分进行分离。B.2检测方法B.2.1待测样品：使用流动相A适当稀释待测抗体。B.2.2液相色谱参考条件：c)流动相A:300mmol/L氯化钠，50mmol/L磷酸钠盐，pH=6.8的水溶液；f)洗脱程序：100%流动相A等度洗脱。B.2.3紫外分光检测参考条件：B.3结果分析分析目标抗体峰及其他峰的峰面积，通过面积归一化法计算抗体的纯度。8GB/T40265—2021(资料性)抗体浓度检测高效液相色谱法C.1原理利用蛋白A(ProteinA)、蛋白G(ProteinG)等蛋白可以特异性识别并结合抗体Fc区域的特点，通过亲和层析检测样品中抗体的浓度。C.2检测方法C.2.1待测样品：使用流动相A适当稀释待测抗体。C.2.2标准样品：使用流动相A将免疫球蛋白标准物质逐级稀释，得到抗体质量浓度为20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L的系列标准工作液，质量浓度由低到高进行检C.2.3液相色谱参考条件：a)色谱柱：蛋白A(ProteinA)亲和层析色谱柱，35mm×4mm(内径),填料粒径12μm或性能相当者；b)柱温：25℃:c)流动相A:150mmol/L氯化钠，50mmol/L磷酸钠盐，pH=7.5的水溶液；d)流动相B:150mmol/L氯化钠，50mmol/L磷酸钠盐，pH=2.5的水溶液；g)梯度洗脱程序见表C.1。表C.1梯度洗脱程序(亲和层析)时间min%流动相B%—3.000000使用外标法计算测试液及待测样品中抗体的浓度。样品溶液中抗体的响应值应在标准曲线的线性范围内，若超过线性范围则应稀释后再进行检测。9GB/T40265—2021(资料性)抗体效价检测间接酶联免疫吸附法D.1原理使用间接酶联免疫吸附法检测抗体效价。抗体梯度稀释的比例宜为1:2,抗体最终稀释度可根据实际情况进行调整。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。所需试剂与材料见A.2。D.3操作步骤9.6)。酶标板每孔加入100μL稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4℃下孵育过夜。D.3.2清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入200μL洗涤缓冲液，室温静置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次～5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300μL洗涤缓冲液，重复5次。D.3.3封闭：每孔加入200μL封闭缓冲液，在37℃恒温培养箱中孵育90min。D.3.5一抗孵育：准备一系列倍比稀释的待测抗体，初始的稀释浓度一般为1:1000,稀释液为抗体稀释液。每孔加入100μL稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复3次。每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的抗体稀释液，重复6次。在37℃恒温培养箱中孵育60min。D.3.6清洗：重复步骤D.3.2。D.3.7二抗孵育：根据二抗说明书稀释HRP标记的二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100μL稀释后的二抗。在37℃恒温培养箱中孵育60min。D.3.8清洗：重复步骤D.3.2。显色工作液。在37℃恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束D.3.10测量：反应终止后30min内，在酶标仪上测量并记录各个孔的吸光度。检测波长为450nm,参比波长为620nm。D.4结果分析D.4.1试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于0.2时，试验成立。反之，应重做试验。D.4.2试验结果分析：当空白对照的吸光度小于或等于0.05时，按照0.05进行效价分析；当空白对照的吸光度大于0.05,并且小于或等于0.2时，按照实际测量结果进行效价分析。D.4.3当样品的吸光度大于或等于空白对照的吸光度的2倍时认定为阳性。结果为阳性的待测抗体的最高稀释度为待测抗体的效价。GB/T40265—2021(资料性)抗体亲和力检测竞争酶联免疫吸附法使用竞争酶联免疫吸附法检测抗体亲和力时，首先让溶液中的抗原与溶液中的抗体充分结合并达到解离平衡，然后将溶液转移至底部包被有相同抗原的酶标板中。酶标板底部的抗原与溶液中游离的分析过程中，酶标板底部抗原与溶液中游离抗体的结合将影响溶液中原有的抗原-抗体解离平衡，干扰检测结果。因此酶标板上包被的抗原量应尽可能低，但同时不影响观测。竞争酶联免疫吸附法检所需试剂与材料见A.2。E.3操作步骤E.3.1选择合适的抗原包被浓度及抗体稀释倍数释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4℃下孵育过夜。置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次～5次。或使用微孔板自动洗板机E.3.1.3封闭：每孔加入200μL封闭缓冲液，在37℃恒温培养箱中孵育90min。E.3.1.4清洗：重复步骤E.3.1.2。清洗结束后将部分酶标板条块拆下并安装在第2个架子上，每孔加E.3.1.5第1块酶标板加样：准备一系列倍比稀释的待测抗体，稀释液为磷酸盐缓冲液(pH=7.2~7.4),初始的稀释度一般为1:1000。每孔加入100μL稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复3次。每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4),重复3次。在37℃恒温培养箱中孵育30min。E.3.1.6第2块酶标板加样：将第1块酶标板中的液体小心吸出，每个浓度的3次重复混合为1管(略少于300pL)。取出E.3.1.4中备用的酶标板条块，将从第1块酶标板吸出的液体加入第2块酶标板中，每孔加入100μL样品，每个浓度重复2次。在37℃恒温培养箱中孵育30min。E.3.1.7第1块酶标板清洗：按照E.3.1.2清洗第1块酶标板。E.3.1.8第1块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释HRP标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100μL稀释后的二抗。在37℃恒温培养箱中孵育60min。E.3.1.9酶标板清洗：按照E.3.1.2清洗第1、2块酶标板。E.3.1.10第2块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释HRP标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每GB/T40265—2021E.3.1.11第1块酶标板显色与测量：每孔加入100μLTMB显色工作液。在37℃恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束后立即每孔加入100μL反应终止液。反应结束后30min内，在酶标仪上测量并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为450nm,参比波长为620nm。E.3.1.12第2块酶标板清洗：按照E.3.1.2清洗第2块酶标板。E.3.1.13第2块酶标板显色与测量：同E.3.1.11。E.3.1.14浓度评价：取两块酶标板中处于线性范围内的测量结果，通过线性回归分析抗体稀释度与显色强度的关系。如果两块酶标板的线性回归的斜率相差10%以内，说明该包被浓度和试验条件适合进行抗体亲和力检测，处于线性范围内的抗体最高浓度适合用于抗体亲和力检测。如果第2块酶标板的显色强度大幅度降低，说明抗原包被浓度过高，应将抗原包被浓度降低至1/5～1/10后重新进行以上试验，直至获得合适的包被浓度。E.3.2亲和力检测E.3.2.1抗原包被：将抗原稀释至E.3.1中判断合适的浓度，稀释液为碳酸盐缓冲液(pH=9.6)。每孔加入100μL稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4℃下孵育过夜。E.3.2.2清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入200μL洗涤缓冲液，室温静置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次～5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300μL洗涤缓冲液，重复5次。E.3.2.3封闭：每孔加入200μL封闭缓冲液，在37℃恒温培养箱中孵育90min。E.3.2.4清洗：重复步骤E.3.2.2,4℃保存备用。E.3.2.5样品准备：将待测抗体样品稀释至E.3.1中判断处于线性范围的最高抗体浓度的2倍，稀释液为磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4)。准备一系列倍比稀释的抗原，稀释液为磷酸盐缓冲液(pH=7.2~7.4),抗原的初始浓度一般为1μmol/L。E.3.2.6抗原-抗体结合：分别将200μL稀释后的待测抗体样品与200μL不同浓度的抗原在新的离心管中混合。每次试验设置空白对照，空白对照为在200μL稀释后的待测抗体样品与200μL磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4)的混合液。37℃恒温培养箱中孵育90min。E.3.2.7加样：将E.3.2.6中反应结束的混合液转移至E.3.2.4保存的酶标板中，每孔100μL,重复3次。在37℃恒温培养箱中孵育30min。E.3.2.8清洗：重复步骤E.3.2.2。E.3.2.9二抗孵育：根据二抗说明书稀释HRP标记的相应二抗，稀释液为抗体稀