用于灵敏检测废水中ermB的便携式生物传感器

正文抗生素抗性基因（ARG）是广泛存在的污染物，对环境和公众健康构成严重威胁，尤其是废水中的ARG是环境中ARG的重要来源。因此，监测和评估废水中的ARG丰度对于环境管理具有重要意义。这里，将LAMP与CRISPR/Cas12a结合，建立了用于检测大环内酯类抗性基因ermB的便携式视觉平台，首先设计了LAMP的6个引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP进行预扩增，并通过碱基配对引导Cas12a识别ermB。由于CRISPR/Cas12a在扩增子识别后具有反式切割活性，使用报告分子修饰的ssDNA探针通过侧流试纸条和荧光进行可视化检测。经过磁珠简单的核酸提取后，所构建的生物传感器具有优异的灵敏度和选择性，使用荧光和废水中的流条可以低至2.75×103

copies/μL，实现了快速、灵敏的可视化现场检测。如Fig.1a所示，该生物传感器的检测过程包括以下步骤：过滤和裂解预处理、磁珠提取、LAMP预扩增、CRISPR/Cas12a系统识别和转导、荧光和横向检测。作者首先设计了针对

ermB

基因的LAMP引物，接下来，设计了Cas12crRNA来特异性识别和检测LAMP预扩增的ermB基因。以一段crRNA为指导RNA，Cas12a可以识别与crRNA识别片段互补的ermB片段。目标序列被识别后，其对ssDNA探针进行非特异性切割的反式切割活性被激活。之后，设计了用荧光和相应的猝灭剂修饰的单链DNA探针(5′−6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用荧光和生物素分子修饰的单链DNA探针(5′−6-FAM-TTATTATT-Biotin-3′)分别用于荧光和侧流装置中的可视化检测。在荧光检测中，在Cas12a反式切割存在的情况下，ssDNA荧光探针解离，释放猝灭剂以恢复荧光信号。结果可以通过荧光读数装置或特定光源激发来直观地读取（Fig.1b）。相反，在没有靶标的情况下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探针不会被切割,因此，没有产生荧光信号。在可视化的侧流检测中，侧流探针的每一侧都用FAM和生物素进行了预修饰。比色侧流试纸条通常由带有gt抗FAM抗体修饰的金纳米颗粒(AuNP)的样品垫、一条用链霉亲和素标记以捕获生物素的对照线和一条带有标记的抗gt抗体以捕获gt抗体的测试线组成。如果没有特异性的LAMP产物，ssDNA探针保持完整，并且由于生物素和链霉亲和素的结合，AuNP可以固定到对照线上，导致红色沉积。相反，AuNPs复合物通过AuNPs和生物素的分离以及gt抗体与抗gt抗体的结合而固定在测试线上，形成红色条带。为了评估LAMP在检测ermB基因时的灵敏度，将PCR扩增产生的目标DNA片段以10倍梯度稀释。结果Fig.2所示，荧光LAMP成功检测到ARG

ermB，LOD为2.75×10

3

copies/μL。DNA浓度与循环阈值时间（CT）之间存在良好的线性关系，线性范围跨越8个数量级，最高可达2.75×10

10

copies/μL。为了进一步提高分析方法的特异性，研究人员将CRISPR/Cas12a系统引入检测中，以解决潜在的假阳性问题并提高灵敏度（Fig

3.a,b）。接着，为了满足复杂现场条件下可视化的各种可能要求，使用荧光和侧流试纸进行可视化检测分析(Fig

3.c,d)。之后，为了验证构建的基于CRISPR/Cas12a的视觉平台的准确性和可靠性，对原废水进行了现场检测（Fig.4）。结果表明，构建的CRISPR/Cas12a可视化平台能够实现废水中ARGs的快速现场检测。总结：开发了一种基于CRISPR/Cas12a的便携式可视化生物传感器，用于快速现场检测和评估废水中的ARG。从取样到出结果的检测过程在2小时内完成，不需要复杂的仪