基因工程的基本操作程序课件 【知识精讲精研】高二下学期生物人教版选择性必修三

基因工程的基本操作程序基因工程从社会中来普通棉花转基因抗虫棉将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？从社会中来培育转基因抗虫棉的简要过程苏云金杆菌

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定Bt基因一、目的基因的筛选与获取1.目的基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。一、目的基因的筛选与获取苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。一、目的基因的筛选与获取2.筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。认识基因结构和功能的技术方法随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。一、目的基因的筛选与获取3.目的基因的获取方法（3）利用PCR获取和扩增目的基因（1）从基因文库中获取（2）人工合成一、目的基因的筛选与获取

基因比较小、核苷酸序列已知,通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库（包含一种生物的所有基因）部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）

（cDNA文库）利用PCR获取和扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR是一项根据

的原理，在

提供参与DNA复制的

与

，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制体外各种组分反应条件PCR——聚合酶链式反应（1）PCR的原理：DNA半保留复制（2）体外PCR所需的基本条件耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP(dNTP)

dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。什么是引物子链延伸子链延伸引物是决定PCR特异性的关键。-5′3′-引物5

′--3′5′--3′引物3′--5′利用PCR获取和扩增目的基因3′5′子链的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板链子链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端引物的作用:

引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)引物参与的组分在PCR的作用目的基因DNA4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)引物缓冲液Mg2+高温使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链维持反应体系的pH激活DNA聚合酶的活性（3）PCR的过程DNA解旋为单链高温(95℃)变性低温(50℃)复性中温(72℃)延伸引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。第1步：变性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。95℃（3）PCR的过程5

′-3

′--3

′-5

′5

′--3

′-5

′3

′-第2步：复性

当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。50℃长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高（3）PCR的过程5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

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′-5

′--3

′-5

′3

′-当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。72℃（3）PCR的过程第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′（3）PCR的过程5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：___个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个③子代只含有目的基因数目：_____个④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个⑤复制过程中共需引物_______个⑥第n次复制需要引物___个2n22n-12n＋1-22n2n-2nPCR扩增DNA规律归纳思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’聚合酶链式反应——过程归纳利用PCR获取和扩增目的基因条件①____：DNA的两条链。②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。③原料：含A、T、G、C四种__________。④酶：

酶。⑤其他条件：需要一定的

溶液和能严格控制温度的温控设备。模板引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合缓冲由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，

因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，

即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。产物模板一倍指数聚合酶链式反应——过程归纳目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列结合；然后以_________为模板在

作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。受热变性解为单链引物延伸单链DNA耐高温的DNA聚合酶引物的3′端脱氧核苷酸每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。变性复性延伸变性：加热至90℃以上，___________________;

复性：冷却至

℃左右，引物与单链DNA结合；延伸：加热至72℃左右，

从引物起始进行

互补链的合成。如此重复循环多次。双链DNA解旋为单链50耐高温的DNA聚合酶思考:用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。mRNA杂交双链单链DNA双链cDNA逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶RNA链

DNA链

比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制场所主要在细胞核内酶解旋酶、DNA聚合酶等温度细胞内温和条件结果合成整个DNA分子联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制细胞外(主要在PCR扩增仪内)耐高温的DNA聚合酶控制温度，需在不同温度下进行扩增特定的DNA片段或基因二、基因表达载体的构建获得目的基因后直接转入受体吗？

不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。1.基因表达载体的作用①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;②使目的基因在受体细胞中能够表达和发挥作用。质粒2.基因表达载体的组成标记基因复制原点终止子限制酶切位点位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。便于重组DNA的筛选，如抗性基因、荧光标记基因等能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上供目的基因插入载体中位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。启动子目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等

项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束二、基因表达载体的构建3.基因表达载体构建的流程相同的限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子限制酶限制酶目的基因与载体的结合过程，实际上是基因重组的过程。选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选思考分析——单酶切的缺点用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒abcda、b、c、d四个黏性末端相同。限制酶切割DNA连接酶连接启动子方向目的基因转录方向思考分析——单酶切的缺点缺点1：在DNA连接酶的作用下，质粒自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析——单酶切的缺点缺点2：在DNA连接酶的作用，目的基因自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析——单酶切的缺点abcd限制酶切割DNA连接酶连接反向连接重组DNA缺点3：在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。思考分析——双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。思考分析——双酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会自身环化目的基因不会自身环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接确保目的基因与载体定向连接，减少重组杂物。分别使用两种限制酶切割目的基因和载体如何选择限制酶来切割图甲和图乙？现学现用

获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。两4PstⅠ、EcoRⅠ三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法植物细胞：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法(感受态细胞法)由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。三、将目的基因导入受体细胞——植物细胞1.花粉管通道法我国科学家独创的一种方法。①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。2.农杆菌转化法①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)

转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。采用最多三、将目的基因导入受体细胞——植物细胞转化目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。受体细胞稳定表达此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。方法①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。受体细胞为_______体细胞受体细胞为_______受精卵三、将目的基因导入受体细胞——植物细胞Ti质粒目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物将目的基因插入染色体DNA中植物细胞三、将目的基因导入受体细胞——植物细胞

__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒重组Ti质粒转入_______转化植物细胞目的基因插入植物细胞中的________________上目的基因在植物细胞中稳定存在并__________表达目的基因T-DNA农杆菌染色体DNA三、将目的基因导入受体细胞——植物细胞①两次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体

细胞染色体的DNA上。②两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

三、将目的基因导入受体细胞——动物细胞显微注射法受精卵注射器固定吸管显微注射仪将含有目的基因的表达载体提纯→显微注射入动物的受精卵→受精卵发育→获得具有新性状的动物受体细胞：受精卵三、将目的基因导入受体细胞——微生物细胞1.原核生物作为受体细胞的优点①繁殖快②单细胞③遗传物质少2.导入方法：Ca2+处理法(感受态细胞法)大肠杆菌感受态细胞Ca2+混合表达载体缓冲液溶于吸收DNA，完成转化使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态

用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射技术D枯草杆菌感受态细胞法B现学现用受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上