食品酶学讲稿

食品酶学讲稿

参考书

1酶工程，郭勇主编，高等学校轻工专业试用教材，中国轻工业出版社;

2酶工程，罗贵民主编，化学工业出版社；

3酶与食品加工，［英］G.G.伯奇等主编，郑寿亭、高培基译

轻工业出版社。

4蛋白质分子基础，陶慰孙等编著，高等教育出版社

CH1绪论

CH1—1酶与食品的关系

1食品酶学概说

食品酶学这个概念，是近儿年提出来的，可以说，到目前仍没有一个完

整的定义，就我们选用的教材也是如此，自始至终，没有对食品酶学下一个

完整定义；近几年全国轻工院校和农业院校的有关食品专业，有条件的都开

设了这门课；可以说，不同院校所开设的内容不很一致，因为不同的任课教

师，对食品酶学的理解和认识的角度不一定相同；总体课程设置不同，用于

本课程的学时也就不同，不管怎样，有一点应该是一致的，食品酶学所开设

的内容应该是与食品有一定关系的酶学内容，也就是说，食品酶学是酶学的

一个分支；在这里我们把食品酶学定义为：食品酶学是专门研究与食品工业

有关的酶学理论及酶工程技术的学科。

2酶与食品的关系

酶与食品的关系非常重要，这不仅现在酶在食品工业上显得重要，很早

以前酶就在食品加工方面起着很重要的作用，在没有酶制剂以前，在利用淀

粉原料发酵时，来利用大麦发芽后转化淀粉成麦芽糖，利用木瓜树叶包裹瘦

肉，以促进肉的嫩化等;目前酶在食品工业上的应用实例可以说是举不胜举。

我们把酶与食品的关系概括以下儿点：

①酶在食品工业上应用可改善食品工艺

②酶工程技术将在开发新的食品资源方面起极其重要的作用。

③酶在食品分析中的应用将越来越得到普及。

④酶在食品加工方面应用也有其不足之处，因酶是蛋白质，具有一定的

免疫原性，有时引起食品的过敏反应，有些酶蛋白本身对人体有一定毒性。

如有些蛋白水解酶...........

CH1.2酶的基本概念

1酶是蛋白质

酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所证明了的，研究酶的化

学本质，可用研究蛋白质的方法进行研究；一般情况下，一个结构完整的酶

包括蛋白质和非蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白质部分

称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。辅助因子的化学本质

因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质

离子，这两部分构成一个完整活性酶体系的必不可少部分，缺少任何一部分

都不能表现出有效酶活力。

例如：

2酶具有催化活性

酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化剂类似，酶在催化反应

时，其本身不发生化学改变，只是催化反应的进行，止匕外，酶在催化反应时,

仅改变反应述度，并不改变反应的平衡。酶催化反应的动力学机理是降低反

应的活化能。

3酶催化反应具有专一性和高效性

酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化剂，根据酶

的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。

绝对专一性是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底物的分子结

构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。

2

例如：乳酸脱氢酶(LactatedehydrogenaseEC1.1.1.27)催化丙酮酸生成

L-乳酸而D—乳酸脱氢酶(EC1.1.1.28)却只能催化催化丙酮酸生成D-乳酸

CH乳酸脱氢酶CH

C=O.；H-C-OH

COOHNADHNAD+COOH

CHD一乳酸脱氢酶CH

C=OvHO-C-H

COOHNADHNAD+COO

相对专一性是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反

应。

例如：胰蛋白酶(TrypsinEC3431.4)催化含有赖氨酸或精氨酸锻基的肽

键的水解反应，凡是具有含赖氨酸或精氨酸玻基酰胺键的底物都能被此酶催

化水解。

CH1.3酶的分类和命名

1酶的分类原则

目前已经认识的酶有3000多种，并且随着生物化学研究的深入，认识

酶的种类不断增加，为了准确地认识某一种酶，避免发生混乱和误解，在酶

学研究和酶工程领域，要求必须对每一种酶都要有准确的名称和明确的分

类。

一般每一种酶有两个名称，一个是它的习惯名称，另一个是其分类名称,

其分类名称一般是根据它的催化底物来命名的。

例如：淀粉酶(Diastase),蛋白酶(Protiase),果胶酶(Pectinase),纤维素

酶(Cellulase)等。

以催化底物命名存在的问题是，当儿种拥有共同底物时就容易混乱。为

此1955年建立的国际生物化学协会(InternationalUnionofBiochemistry)酶学

3

委员会(EnzymeCommission)□自1956年开始进行酶的系统命名和分类研究,

于1961年该委员会正式提出了酶的分类命名方案。

系统命名：是将底物和催化的反应同时考虑，进行命名，如：

a-1,4葡萄糖水解酶；

对于双底物的将两底物用冒号分开：如：ATP:己糖磷酸转移酶；

对与可逆反应的，一般正反应和负反应用同一个名称，主要考虑催化的

主要方向，或根据首先证明的催化反应来确定。如乳酸脱氢酶。

此后，分别在1964年、1972年、1978年、1984年进行了修订与补充,

形成了一套目前为普遍接受的酶分类体系；系统命名分类体系根据酶催化反

应的类型将酶分成6大类，即：

氧化还原酶.......................(1)

转移酶...........................(2)

水解酶...........................(3)

裂合酶...........................(4)

异构酶...........................(5)

合成酶...........................(6)

酶的分类编号原则是采用四码编号方法，第一码代表6大类中的哪一

类，第二码代表大类中的亚类，第三码表示亚类中的小类，第四码表示小类

中不同酶的排序号；四位号码之间用圆点(.)分开。

例如：水解酶类3」是作用于酯键的亚类3.1.1水解竣酸酯键

3.1.2硫醇酯键

3.1.7二磷酸单酯

3.2作用于糖基化合物3.2.1水解糖背键

3.3作用于酸键

3.4作用于肽键

2同功酶的概念

笼统地讲，同功酶应该是指那些具有相同催化功能的不同的酶形式，这

4

些不同形式主要表现为酶蛋白分子的一级、二级、三级、四级结构和辅酶或

辅基的差异，但是，在酶学上的概念仅那些具有相同催化功能，而由于遗传

因素所引起的氨基酸序列不同的酶，换句话说，两个同功酶，必须是由两个

结构基因编码的，如果由同一基因编码，而仅仅是在蛋白合成后的修饰过程

的差异不能归同功酶这个概念。

3酶活力概念及活力测定

在酶的生产及其应用过程中，衡量酶量的多少的概念有酶的质量和酶的

活力，质量概念仅仅是一个相对量，由于不同来源的酶制剂，其纯度不同，

所以其应用效果有很大差异，因此，在酶学及酶工业上，用酶活力来表示酶

量的多少。

酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应述度。酶的活力越大，反应

述度越高。我们知道，酶催化反应述度，用单位时间内底物的减少量或产物

的增加量表示：

dsdp

v=------------=-------

dtdt

既然用酶活力表示酶量，就必须有一个相应的量的单位，即酶的活力单

位；关于酶活力单位定义在我国较为混乱，不同的酶采用不同的单位，目前,

对淀粉糖化酶(Glucoamylases)、果胶酶(Pectinases)、纤维速酶(Cellulases)等,

普遍采用以在最适条件下，每小时产生lmg产物或转化Img底物的酶量即

为一个酶活力单位(U)。其他国家也不尽相同，酶学委员会(E.C.)对酶活

力单位作了统一规定，酶活力单位定义为：在特定条件下(酶的最适反应条

件)，每1min催化1umol底物转化成产物(或产生1Umol产物)的酶量

即为一个酶活力单位(U)；这个单位又称为国际单位(IU)。

近些年来，提出了一个更大的酶活力单位，即'Katai',一个'Katai'

单位是在一秒钟内，转化一摩尔底物的酶量。

1Katal=6X107U

酶的活力单位和质量单位虽然都是酶量多少的标志，两者之间无法彼此

对应，为此，人们引用了酶比活力这个概念。即每mg酶制剂所含的酶活力。

5

酶比活力=酶活力（U）/mg酶制剂

酶活力的测定方法

酶活力的测定方法多种多样，总的要求是快速、简便、准确。

总的说，无论用什么方法，都包括以下几个要点

①提供最适底物：由于酶的底物专一性，测定酶活力时，提供的底物必

须是最适底物，当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。

②测定时酶量适当，酶量太小，形成的产物或转化的底物太少，不利于

测定，酶量太大，一方面形成的产物太多，超越测定范围；此外，当酶量太

大时，底物不能使酶最大饱和，测定的反应述度不是最大反应述度。

③确定反应时间，既然；测定酶活力是测得最大反应述度，反应时间太

长，随着反应进行，底物不断减少，到反应后期，反应述度下降，测定出现

误差；反应时间太短，在操作过程中，人为的时间误差很大，也不利于准确

测定。

④反应条件应是最适反应条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离

子环境。

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CH2酶学概论

CH1-1酶的结构和功能

酶的化学本质是蛋白质，酶包括单一酶和结合酶两类，单一酶的催化活

性仅由其酶蛋白部分完成，而结合酶的催化活性，除蛋白部分外，还需要金

属离子或其它小分子有机化合物作为酶的辅助因子。结合酶又称为全酶，其

由酶蛋白和辅助因子两部分组成。无论是单一酶还是结合酶，其蛋白质部分

的结构构成其功能的结构基础。

1.酶催化功能的结构基础

1.1酶的活性中心

酶是大分子生物活性物质，一般来讲，分子量至少都在1O4以上，由

数百个或更多的氨基酸残基组成。现已证明，在酶蛋白上，只有少数氨基酸

残基和酶催化活力直接有关。这些氨基酸残基一般不集中在肽链的某一区

域，也不相互毗邻，往往分散在相距较远的氨基酸序列中，甚至有的分布在

不同的肽链中。显然，这些氨基酸呈分散状态时，不能发挥其共同的催化活

性，这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中，

构成一个特定的与酶活性表达有关区域，这个特定区域即酶的活性中心

(activecenter),换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反

应的特定基团或特定区域。

酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其二是催化部位；底物

结合部位是酶与底物特异性结合的部位，又叫专一性决定部位。催化部位直

接参与催化反应，底物的敏感键在此部位被催化形成相应的产物。底物结合

部位和催化部位两者不能绝对分开，任何单一部位都不能孤立地发挥作用，

有时两者合二为一。

例如:

7

1.2酶催化的邻近和定向效应

邻近效应是指A和B两个底物分子结合在酶分子的结合部位上，两分

子的反应基团相互靠近，从而降低了两分子进入过渡态所需要的能量，或说

增加了两分子反应基团的发生反应的空间机率。

A、B两个分子进入过渡太，两分子的反应基团的需要按一定的方向重

叠或交叉，这一方向稍有偏离，反应就难以进行或增加很大能量才能进行，

这种酶活性部位赋予底物的这一方向性即定向效应。

1.3酶的别构部位(allostericsite)

酶分子表现其活性是以完整的结构为基础的，某些酶除其活性部位外，

还有一个别构部位影响酶的活性，这些酶又称为别构酶或变构酶。多为代谢

代谢调节酶，由别构部位的变构改变酶的活性，别构部位的变构也是通过与

一个配体结合来实现的，但其与酶的活性部位不同，别构部位结合的配体不

是底物，而是一个调节酶活性的效应物。

2.酶催化专一性的经典学说

2.1锁钥学说(lockandkeytheory)

1894年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说，以解释酶与底物之间

的专一性问题，其基本含义是：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在

结构上有严格的互补对应关系，当底物与酶结合时就象钥匙和锁那样契合对

应。

锁钥学说对于了解酶的立体专一性及酶与简单底物结合的动力学理论

有一定的邦助；但锁钥学说，认为酶的活性部位就象锁那样有着固定的结构,

并且是一个不变的刚性结构，作为钥匙的底物不能有任何结构上的改变，尽

管锁钥学说有其合理的内核，但有许多实验事实该理论不能解释。

8

2.2诱导契合学说(induced-fithypothesis)

1958年，Koshland提出了诱导契合学说，其主要内涵是：当酶与底物

分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于与底物分子结合

或催化的变化，酶与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。

本学说继承了锁钥学说酶与底物特异结合的合理内核，同时拼弃了其机

械不变的刚性理论。诱导契合学说，不仅能解释锁钥学说不能解释的实验事

实，而且近年来运用物理化学方法，如X—射线衍射分析、旋光色散分析、

圆二色性分析、核磁共振、差示光谱等现代研究方法，确实证实了酶与底物

结合时，酶的构象发生改变。

CH1.2酶催化反应的动力学

酶催化反应动力学所研究的主要内容包括酶浓度、底物浓度、温度、pH、

离子强度、激活剂和抑制剂等诸因素对酶催化反应的影响。

由于酶分子是一个大分子生物催化剂，催化反应的体系非常复杂，因此

酶催化反应动力学是一个复杂的研究课题，在这里我们仅讨论酶催化反应动

力学的儿个基本问题。

1.酶催化反应的初述度

酶催化反应的述度是用单位时间内产物的形成或底物的减少量来表示

的，对于一个酶催化反应S---------P

d[s]d[p]

V=----------=----------

dtdt

9

图1酶催化反应述度图2酶催化反应的初述度

可以看出，反应述度随反应的进行，而逐渐降低，因此研究酶催化反应

动力学，反应述度的概念必需是一个特定时间下的述度，通常研究酶催化反

应动力学采用的反应述度是引用初述度这个概念，初述度即反应时间为零时

的极限述度，因为只有初述度是在理想条件下进行的反应述度，干扰反应述

度的因素最少。图中曲线的斜率即为初述度

2.底物浓度对反应述度的影响

以单底物-单产物的酶催化反应模型为例，当酶量固定不变时，底物浓

度对反应述度的影响见图3

2.1Michaelis-Menten迅述平衡学说及Henri-Michaelis-Mentwen方程

单底物酶促反应模型：

klkpk3

E+S------------ES------------E+P

-kl

图3底物浓度对反应述度

迅述平衡学说对上述反应模型有两点假定：①酶与底物结合形成酶底物

复合物的述度很快。②整个反应述度取决于酶底物复合物释放出游离酶和形

成产物的反应述度，因此反应述度

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v=kp[ES]...........................................................(1)

Ks=[E][S]/[ES](Ks是ES的分解常数)....(2)

[ES]=[E][S]/Ks...................................................(3)

如果我们设反应体系中酶的总浓度为口,当反应达到平衡以后，酶分子以

下列两种形式存在：[EO]=[E]+LES]...............................(4)

将3式分别和1式4式加以整理便得：

v=Kp[E][S]/Ks...........(5)

[EO]=[EJ+[E][S]/Ks...................................(6)

将5式除以6式得：

Kp[E][S]/KsKp[S]/Ks

v/[EO]=.......................................(7)

[E]+[E][S]/Ks1+[S]/Ks

.将两边都乘以1/Kp

[S]/Ks

v/Kp[EO]=.(8)

1+[S]/Ks

,/v=Kp[ES]只有当[EO]全部转变成[ES]时，反应才能达到最大反应

述度。Vm=Kp[E0].................................(9)

将9式和8式整理得：

[S]/Ks[S]

v/Vm=----------------=-------------------.......(10)

1+[S]/KsKs+[S]

Vm[S]

v=..........................(11)

Ks+[SJ

11

这就是Hemri-Michaelis-Menten方程。也就是我们所说的米氏方程。

我们总结一下，利用迅述平衡学说进行米氏方程的推导有以下三点基本

假设：

①在反应模型中，不考虑ES-E+P的逆反应，然而，对于大多数酶促

反应来说，反应是可逆的，要忽略这一逆反应，只有在反应的起始，产物P

f0时才成立。

②[S]大大高于[E]值，在反应过程中，底物的消耗可忽略不计。

③ES解离成E+S的述度显著快于ES形成E+P的述度，即ES-E+P的

反应不影响E+S---------ES的平衡。

2.2恒态学说及对米氏方程的修正

事实上迅述平衡学说对很多反应不太适宜，为此，1925年，Briggs和

Handane对米氏方程进行了修正,提出了恒态学说。其基本内涵是：在初述

度测定过程中，底物浓度随反应时间而降低，产物相应增高；而中间复合物

ES可在相当一段时间内保持浓度的恒定状态。Briggs和Handane对米氏方

程的修正，保留了迅述平衡学说的前两点假设，因此，反应模型仍为：

klkp

E+S-------------ES-------------E+P

-kl

底物的消耗述度为K1[E][S],底物的消耗用于ES的形成，ES已经形成,

就会按K1[ES]的述度解离成E+S,同时ES按Kp[ES]的述度形成E+P。

v=Kp[ES]..........................................................................(1)

[EO]=[E]+[ES]................................................................(2)

v/[EOJ=Kp[ES]/{[E]+[ES]}.......................................(3)

v/Vm=[ES]/{[E]+[ES]}...............................................(4)

恒态学说认为：

Kl[E][S]=K-l[ES]+Kp[ES]=(K-l+Kp)[ES]……(5)

[ES]=K1[E][S]/(K-1+Kp)............................................(6)

定义:(K-1+Kp)/Kl=Km................................................(7)

[ES]=[S][E]/Km.....................................................(8)

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将(8)式代入(4)式得:

[S][E]/Km

v/Vm=------------------------=[S]/(Km+[S])....(9)

[E]+[S][E]/Km

Vm[S]

v=......................................................................(10)

Km+[S]

(10)式即为修正的单底物酶促反应动力学方程，为了纪念

Michaelis-Menten创造性工作，这个方程也称为Michaelis-Menten方程，简

称米氏方程。式中Vm为最大反应述度，Km为米氏常数。

2.3关于米氏方程意义的讨论：

①反应述度v是底物浓度[S]的函数，其儿何意义是一条双曲线，当[S]

远远大于Km{[S]》Km}时，V-Vm；在测定酶活力时，必需提供足够大的

底物浓度；反之,当[S]《Km时，V-Vm[S]/Km,因为在一定条件下，对于

一个酶来说，Vm/Km是一个常数，所以，反应述度V与底物浓度⑶成宜线

关系，在酶法分析中，利用酶测定底物浓度时;应提供足够大的酶浓度，使

得产物与底物浓度成直线关系，以根据产物的形成来测定底物浓度。

②Km是酶促反应的动力学常数，其等于当达到最大述度一半时的底物

浓度。Km值是酶的一个特征性常数，它不受酶量，酶的纯度的影响，当pH、

温度、介质的离子强度等不变时,Km值不变。它是酸介底物亲和力的标志,

Km值越大，标志要使反应速度达到最大反应速度一半时'必须提供的底物

浓度越大，即酶与底物的亲和力越小；反之亦反。

③因为Vm=Kp[E0],所以，当底物浓度足够大时，最大反应述度Vm

与酶量成正相关，因此Vm是随酶量而变化的常数。催化反应的Vm应换算

成酶的催化常数Kcat,Kcat是每摩尔酶催化每摩尔底物转化或产生每摩尔

产物所需的时间。

3酶浓度对酶活力的影响

根据米氏方程V=Vm[SJ/{Km+[S]}

当底物浓度足够大时，V-Vm=Kp[E0]

因此，酶促反应述度与酶浓度在一定的底物浓度范围内与酶浓度成正

13

比。

4pH对反应述度的影响

大部分酶的活性受pH的影响，在一定的pH条件下，酶促反应具有最

大反应述度，当pH高于或低于该pH值时，反应述度都降低；此pH范围即

为最适pH。用酶活力对pH作图，便得到一条钟形曲线。

图pH对酶活力的影响

pH对酶活力的影响主要表现在以下儿个方面：

①pH的改变影响酶的空间构象，从而引起酶活力的改变。

②pH影响酶活性中心催化基团的解离，影响酶与底物的亲合力或催化

活性。

③pH影响底物的解离状态，改变底物的可给性。

5温度对酶促反应述度的影响

从实验结果来看，温度对酶活力的影响，类似于pH对酶活力的影响,

以酶活力对温度作图，便得到一条钟形曲线。

图温度对酶活力的影响

温度对酶活力的影响，主要表现在两个方面，一方面温度的改变影响着

酶的稳定性，在低温条件下，主要表现为可逆行失活，随温度的恢复酶活力

也得到恢复；在高温条件下，表现为不可逆行失活。另一方面，温度直接影

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响酶促反应的进行，根据Arrhenius方程：k=Ae-Ea/RT可以看出，述度常

数k与绝对温度T成正比。

CH3酶工程技术概论

酶工程技术作为生物工程技术的四大领域之一，目前可以说，在生产上

发挥着巨大作用的当为发酵工程和酶工程技术。概括地讲，酶的生产和应用

的技术过程即称为酶工程。酶工程技术主要包括内容有：酶的发酵生产、酶

的分离纯化、酶分子的修饰、酶的固定化和酶反应器、以及酶的应用工程技

术。

酶工程的主要任务是：通过预先设计经过人工操作而获得大量所需要的

酶，并通过各种方法使酶发挥最大的催化功能。

CH3-1酶的发酵生产

所有生物体在一定条件下都能产生多种酶，酶在生物体内产生的过程，

称为酶的生物合成。目前工业酶制剂的主要来源主要包括：通过微生物发酵

生产和从动植物细胞中提取两个途径。

以前\酶的发酵生产，主要是利用微生物发酵来完成的；目前♦,酶的发

酵生产已不限于微生物，利用动植物细胞的发酵已成为可能，无论是微生物

还是动植物细胞，用于酶的发酵生产，必需具备以下几个条件：

①必需具有优良的产酶性状，产酶水平高到使生产成本降低，能满足工

业化应用要求，否则就不能用于生产。

②细胞易于培养和生长发育，也就是细胞必需具有快述生长繁殖的特

点，并且对发酵的营养基质要求不高。

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③细胞的产酶性能必需稳定，只有细胞具有稳定的生产性能，才能够进

行稳定的发酵生产。

④最好选用产胞外酶的细胞，并且其它副产物少，有利于酶制剂的提取

和提纯。⑤细胞必需无毒无害，尤其是用于食品工业的酶制剂，必需保证

无毒无害。这是衡量细胞能否用于食品工业酶制剂生产的主要指标。

尽管生物技术已取得突破性进展，目前酶制剂生产还主要以微生物为

主。我们这里仅介绍利用微生物发酵生产酶制剂的有关问题。

1发酵原料和辅助性原料

1.1碳氮源

利用微生物生产酶制剂的主要原料是碳源和氮源，此外还有无机盐、生

长因子和产酶促进剂。这些发酵原料与微生物的培养基原料类似。但是，考

虑发酵培养基的原料时，除有利于发酵微生物的生长繁殖外，更重要的考虑

因素是：首先所有原料成分，应该有利于酶的产生或不影响酶的产生；其次

要考虑原料成本，我们生产商品酶制剂，生产成本的高低，直接影响着企业

的经济效益。签于上述考虑，目前所利用的有机碳源，主要是来源于农副产

品原料，用的最多的有甘薯干、玉米、效皮、米糠等等；有机氮源主要有油

料作物的籽实在榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜籽饼、棉籽饼等，此

外无机氮源也比较常用，如硫酸铁、氯化钱、硝酸镂、磷酸氢二镂、尿素等。

1.2产酶促进剂

在发酵培养基中添加某些少量成分，能显著提高酶的产量，这类添加成

分即为产酶促进剂。常用的产酶促进剂是产酶的诱导物或表面活性剂，诱导

物主要是对那些诱导酶的产生诱一定的诱导作用，能显著提高酶的产量；而

表面活性剂则是通过改变细胞的通透性，促进酶的分泌，从而提高酶的产量。

下表是表面活性剂吐温80(0o1%)对多种酶产生的影响：

酶来源酶产量增加倍数

纤维素酶多种霉菌20

转化酶多种霉菌16

3-1,3葡聚糖酶多种霉菌10

16

B—葡萄糖甘酶多种霉菌8

木聚糖酶多种霉菌4

淀粉酶多种霉菌4

酯酶多种霉菌6

2发酵方法

利用微生物生产酶制剂的发酵方法分固态发酵法和液态发酵法，对于酶

制剂生产来说，两种方法各有侧重，各有特点。

2.1固态发酵法

固态发酵法又称为款曲培养法，该法是利用裁皮或米糠为主要原料•，添

加其它辅料，制成固体培养基，进行发酵的一种方法。该方法的特点是：①

本法对设备条件要求简单，适合投入力量不足的乡镇企业生产；②此法利用

固体培养基，由于秋皮、米糠等的通气性好，尤其是对于好氧性微生物的发

酵，通气对产酶的影响很大；③固态发酵的产酶效率高，一般情况下，每克

发酵基质的产酶量是液态发酵每毫升发酵液的10倍；④但是，液态发酵有

其局限性，首先，液态发酵需要繁重的劳动，需更多的人力投入；其次，固

态发酵不利于自动化控制。

根据固态发酵所使用的设备和通气方法不同，常用的发酵方法有以下儿

种：

①浅盘发酵法：此法是将固体培养基平铺在浅盘内，进行微生物的培养

和产酶，一般都是用木制的浅盘或竹编的匾框，铺培养基约3〜5厘米厚，

控制温度和湿度进行发酵。

②转桶发酵法：此法是将固态培养基接种后，在可旋转的桶内进行发酵,

发酵桶在发酵过程中，慢慢地进行旋转，以有利于通气。

③厚层通气发酵法：又叫深池发酵法，此法是在浅发酵法的基础上发展

起来的，在发酵池的底部，设计成多孔假底，在发酵池内铺20-30厘米厚的

培养基，（近年来，在国外已发展到，培养基的厚度达到1〜2米厚），当

接种的微生物开始生长，曲温开始升高时，在发酵池的假底下通入具有一定

湿度和温度的空气，本法与前两种方法相比，投资稍大，但其生产效率远高

17

于前两种方法。

2.2液态发酵法

液态发酵方法，是利用液体培养基进行微生物生长繁殖和产酶的，其特

点是：①液态发酵的自动化控制程度高，节省人力投入；②液态发酵生产的

酶制剂易提取制备。③液态发酵适合于大规模生产；④液态发酵的投资要求

高，要求生产的技术条件高。

液态发酵方法在很早是利用液体表面发酵法，此法是利用发酵盘或发酵

箱，装浅层发酵液，进行静置发酵，目的是让发酵液与空气有充分的接触面

积，但是，此法，最大弊病是不利于防污染，发酵周期长；目前此法已趋于

淘汰。

目前液态发酵普遍采用的是'液态深层通气发酵法'，此法所需要的主

要设备是发酵罐和密闭通气装置，目前我国在酶制剂生产中，采用的发酵罐

最大的是50吨罐，小的有10吨罐，发酵培养基配制、灭菌冷却等都是在一

个罐中完成，这对于防污染非常有利，目前发达国家，液体发酵已开始进行

连续发酵，而我国现仍沿用着分批发酵法，由于连续发酵法的生产效率很高,

但对于防污染，防噬菌体的侵染问题难度较大。

3发酵产酶的影响因素

酶制剂的发酵生产，除菌种的生产性状和发酵培养基对产量有显著性影

响外，发酵工艺条件对酶的产量也有很大的影响，主要有发酵温度、基质的

pH值，通气量等发酵条件。

3.1发酵温度：

对于微生物来讲，其生长繁殖需要一定的温度，酶蛋白的合成也需要一

定的温度，一般情况下，微生物的最适生长温度与其最适产酶温度稍有差异,

所以，在发酵产酶时，发酵工艺温度控制，应在微生物生长时期和产酶时期

作相应的调整，以提供相应的最适温度；在刚接种的初期，微生物尚未大量

生长起来，这一阶段，主要是通过供热和保温来保持发酵液温度的恒定大量

微生物生长起来以后，由于微生物细胞的代谢旺盛，这时，发酵液的热量来

源主要有细胞的代谢热、通气带入的热量和发酵液机械搅拌产生的机械热。

这些热能足以使发酵液的温度上升，所以，这个时期控制发酵液的温度主要

是进行降温冷却。

18

3.2基质的pH值：

酶制剂生产中，种子培养基和发酵培养基的pH值直接影响着酶的产量

和质量。在发酵过程中，微生物的代谢活动也与基质的pH值直接发生关系,

一方面代谢活动受pH的影响，同时由于代谢过程中，不断有代谢产物分泌

到周围环境而改变基质的pH值，所以在发酵过程中，发酵液的pH值会发

生不断改变，对于微生物细胞来说，其产酶的最适pH范围是固定的，发酵

液pH的改变势必要影响微生物的产酶效率。

发酵液的pH改变还受到其它条件的影响，如果发酵液中以碳源物质为

主，在发酵过程中，pH的变化趋势是随着发酵进行而下降；反之，如果氮

源物质占很大比例，则pH趋向上升的变化。另外通气量的大小也影响着pH

的变化，当量大时，细胞的有氧代谢占主导地位，糖和脂肪的氧化进行较为

彻底，其最终产物是二氧化碳和水，pH的变化就相对慢些，反之，当通气

量不足时，碳源物质的氧化不彻底，大量有机酸中间产物积累，pH降低较

快。

在酶制剂发酵生产中，必须采取方法控制发酵液pH的变化，使其保持

恒定不变；控制pH变化的方法通常是通过调节培养基起始pH值，添加一

定的

pH缓冲剂，调节基质中的碳氮比，使在发酵过程中，基质的pH保持在一

定范围，必要时，还可以添加酸碱调节剂来恒定pH值。

目前，在液态发酵法生产中，都是自动调节控制的，通过安装在发酵罐

里的pH敏感电极来进行自动化调节。

3.3通气量

对于好氧性微生物，在其生长繁殖过程中，需要不断地从周围环境吸收

氧，由于在液态发酵时，微生物细胞混悬于液态基质中，细胞不能直接吸收

空气中的氧，必须通过氧分子溶解在发酵液中，细胞吸收基质中的溶氧，一

般情况下，细胞吸收氧气，是通过简单扩散的吸收方式来吸收的，所以，要

保证细胞有充足的氧气供应，发酵液中必须有一定浓度的溶氧。溶在发酵液

中的氧气不是固定不变的，一方面它不断被微生物细胞消耗，另一方面，它

还不断地从空气中吸收，如果说发酵液中的溶氧恒定不变的话，那仅是一个

动态平衡。不同微生物，对氧的需要量不同；我们把单位时间内发酵液吸收

空气中的氧气量叫溶氧述率，对于一个特定菌种来讲，对发酵液的溶氧述率

有一个特定的要求，溶氧述率过高或不足都不利于酶的产生。如用来生产淀

19

粉糖化酶的黑曲酶，在发酵的早期，大量菌体生长，适宜的溶氧述率为

50-55mmoL「.h”,到大量酶蛋白产生时，其需要适宜的溶氧述率为20

1

mmol.r'.h-o

控制发酵液溶氧述率的方法主要是通过直接给发酵液通气，同时进行搅

拌，搅拌的作用是促进氧气的传递，增加溶氧量。

3.4泡沫和消泡剂

在液态发酵时，由于通气和搅拌，在发酵液表面形成大量泡沫，并且形

成的泡沫持久性很强，在发酵液表面的泡沫层阻碍了发酵过程中产生的CO2

的排除以及发酵液对02的吸收，从而将严重影响酶的产生。

在发酵过程中，必须采取措施消除泡沫，消泡的方法主要有机械法：在

发酵罐的搅拌轴的上端（在发酵液面以上）装搅拌桨，在发酵搅拌的同时，

消泡搅拌桨打击泡沫，起到消泡的作用。一般情况下，仅仅靠机械消泡是不

够的，还必须配合消泡剂添才能起到充分消泡作用，添加的消泡剂必须具备

以下条件：①表面张力较低，并且难溶于水或不溶于水；②必须不对发酵微

生物的正常代谢产生阻碍作用；③无毒无害物质，尤其是生产食品工业酶制

剂，此项要求更为严格；④价格便宜取材方便。

目前已认识到能供消泡剂使用的主要有：矿物油类、脂肪酸类、脂肪酸

酯类、酰胺类、酸类、磷酸酯类聚硅氧烷等，我国酶制剂生产常用的是聚氧

丙烯甘油酸、泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油酸），前者是非电离性高分子

表面活性剂，外观为淡黄色油状物，难溶于水，易溶于乙醇和苯等有机溶剂,

消泡能力强，用量少，并且性能稳定，耐高压灭菌，在酶制剂发酵应用中，

无不良影响，对人体有无慢性中毒问题尚未确定。

3.4湿度

在固态发酵时;培养基的湿度（即水分含量）和发酵室空气中的相对湿

度对微生物的生长繁殖及产酶有很大关系，不同的菌种，对湿度的要求不同,

在发酵过程中，不同的发酵阶段也不完全一致，一般在菌体大量生长阶段要

求湿度低些，而在大量产酶阶段要求湿度高些。

CH2-2酶制剂的制备和精制

由于发酵微生物的种类不同，有的是以胞内酶为主，有的以胞外酶为主,

无论哪一种，最终得把它们提取出来，并使其达到一定的纯度，这就是酶制

20

剂的制备和精制的任务。目前我国生产的工业酶制剂，普遍纯度较低，而目

前在世界上占统治地位的丹麦NOVO公司生产的酶制剂的纯度远远高于我

国的产品。如果胶酶(Pectinases),NOVO公司生产的酶制剂的比酶活力较我

国最好的产品高5—10倍，随然酶制剂的价格较高，但其在生产上应用成本

远低于我国的产品。

1酶制剂的工业提取方法

酶制剂的工业提取法是指工业上大批量提取制备方法，工业上用的酶制

剂，一般用量较大，但对酶的纯度要求不高，尽管如此，工业酶制剂也要求

酶的纯度在生产允许的条件下，尽可能地提高酶的纯度。下面我们介绍一些

酶制剂的提取制备方法：

1.1细胞破碎方法

对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内的酶蛋

白游离出来，常用的破碎方法有以下儿种：

1.1.1机械破碎法

机械破碎法是指通过机械运动产生的剪切力来破碎细胞，主要包括以下

几种：

①机械捣碎法：利用捣碎机的高述旋转叶片来打碎细胞，一般要求旋转

述度达到10000转/分，才能达到破碎效果。此法适合于规模生产。

②研磨法：此法是通过研磨来实现破碎细胞的目的，其在大规模工业化

生产上不适合，只适合于实验室的小规模操作。

③匀浆法：利用匀浆器进行匀浆，在匀浆器内加有硬质的玻璃磨砂，在

匀浆过程中，通过玻璃砂彼此磨擦来破碎细胞；此法对细胞的破碎程度较高,

但操作规模小，不适于大规模生产。

1.1.2物理破碎法

通过控制物理因素来破碎细胞的方法称为物理破碎法，主要有：

①温差破碎法：主要是利用反复冻熔的方法来破碎细胞，这种方法仅适

合于实验室操作。

②超声波裂解法：通常我们听到的声音频率范围是16-20kHz,频率高于

20kHz的声波称为超声波，实验证明，超声波的频率对其对细胞的破碎作用

21

没有明显影响，影响其破碎作用的因素主要有：超声发生器的输出功率、作

用时间、介质的浓度、粘度、pH等。

目前多采用界于声波和超声波之间的频率(15-25kHz),一般操作条件

为:功率100—150W,介质的pH为4—7,在0—10°。条件下处理3—lOmin,

一般情况下，在超声波处理时，要间歇进行，否则局部产热，易使酶蛋白变

性而使活。

此法，在实验室应用具有简单、快速、效果好等特点，但目前应用到规

模化工业生产还有一定困难。

1.1.3化学方法

目前有效的化学方法主要是加入表面活性剂法常用的有：特里顿X-1OO

和吐温(Tween),其主要是破坏细胞膜的结构，增加膜通透性。此法在实

验室和生产上已成功应用。

1.2工业酶制剂的提取与制备

工业酶制剂的提取方法很多，并且不同的酶要求采取不同的方法，不同

的厂家，有其自己的独特经验，采用的工艺技术路线也不尽相同，下面介绍

一些常用的主要方法。

1.2.1发酵液的预处理

发酵液首先要进行过滤除菌，由于在发酵液中，有菌体的自溶产生的细

胞碎片、核酸、蛋白质等大分子物质，使得发酵液很难过滤；在过滤前必须

进行一定的预处理过程。

发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常用的絮

凝剂有聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)磺化聚苯乙烯(PolystyreneSulfonate),

絮凝剂加入，主要有以下三方面的作用：①改变发酵液中'悬浮粒子的物理

特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；②使一些可溶性的胶体物质

变成不溶性的沉淀粒子；③降低发酵液的黏度。

1.2.2酶液的脱色

这一步骤可根据酶制剂的要求而定，一般食品工业酶制剂允许含有来源

中的色素，所以就不脱色；尽管如此，目前大部分工业酶制剂都要进行脱色

处理过程。

常用的脱色剂有活性炭和离子交换树脂，活性炭吸附法，操作效率较高,

脱色较彻底，但在脱色的同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；离子交换树脂

基本上在脱色的同时，不吸附酶蛋白，现有一种特制的低交联度的大孔树脂,

22

用于脱色效果很好。

我国生产了一种脱色专用树脂：通用1号脱色树脂，在弱酸性条件下，

其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素，树脂的再生方便再生的条件是：

先用5%的NaOH洗脱色素，待色素洗脱干净后，用蒸储水洗到中性，再用

5%的HC1（二倍树脂床体积）中和树脂，再用蒸储水洗到pH5.0-5.5为止。

1.2.3酶蛋白的初步纯化与浓缩

在发酵液中，酶蛋白的浓度一般不会太高，并且在发酵液中混有很多其

它代谢产物，即使是高产菌种。从发酵液中提取酶制剂，首先要对发酵液进

行浓缩和酶蛋白的初步纯化，经典的方法有以下几种：

⑴盐析法

盐析的基本原理：

蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少呈正相关，即蛋白质的极

性越强，其溶解度越大，溶液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋

白质的水合程度，降低其溶解度；另一方面，电荷部分地中和蛋白质分子上

的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；此外，溶液中的

盐离子引起水分子的极化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使

可溶性蛋白在水溶液中析出。

在盐溶液里，蛋白质的溶解度的对数值与溶液里的离子强度成线性关

系，人们总结了以下经验公式：

logS=B-Ks.u

S:Protein的溶解度g/1；B为溶液离子强度为零时的logS,B值受蛋白

质性质和盐离子的种类以及溶液的温度pH值的影响；Ks为盐析常数，其因

蛋白质而性质和盐离子的种类不同而不同；U为溶液的离子强度，

M=------------

其中Ci为离子的摩尔浓度；Zi离子所带电荷数

如果以经验公式做图如下：

23

盐析的基本方法：

蛋白质的盐析方法主要有以下两种：

Ks盐析法：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度

（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铁。

B盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到

蛋白沉淀的目的。

在实际工作中，常用的是Ks盐析法,利用不同饱和度的（NHOzSCU浓度,

这样不同的蛋白质析出沉淀的（NHD2SO4浓度不同；通过这种方法可将部分

杂蛋白分离出去，达到浓缩酶蛋白的目的。

具体操作方法：饱和溶液法和干粉加入法。

盐析后的脱盐：透析法和凝胶过滤法。

⑵有机溶剂沉淀法

除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，关于有机溶

剂法沉淀蛋白质的原理还不是很清楚。目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙

醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的价格高，在蒸储回收时，损失

较多，所以目前多采用乙醇作沉淀剂。

沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多因素影响，溶液的离子强度、温度、pH

值等都影响蛋白质的析出，低浓度的盐离子有促进蛋白质溶解的作用，即所

谓的盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇的浓度要增加；温度

升高蛋白质的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇浓度增加；pH值的影响

因不同的蛋白质而不同，一般情况下，当溶液的pH值与酶蛋白的等电点一

致时，需要的乙醇浓度最低，偏离酶蛋白的等电点越远，酶蛋白所带电荷越

多，蛋白质的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。

一般作为沉淀剂的乙醇浓度是95%,沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有

差异，如沉淀枯草杆菌的淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积的发酵

液加0.2—0.8体积的乙醇；当沉淀蛋白酶时，加0.8—1.1体积的乙醇沉淀出

的主要是中性蛋白酶，加1」一1.4体积的乙醇时，沉淀出的主要是碱性蛋白

酶。对于每一种酶蛋白的沉淀要求乙醇的适宜浓度需要实验确定。

⑶喷雾干燥法

此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法的

生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定的局限性，在喷

24

雾干燥时，需要一定的温度，在喷雾塔里面进如一定温度的热空气，对于那

些对热不稳定的酶蛋白不宜使用，现用在生产的主要是生产a-淀粉酶。

⑷膜分离技术

除上述经典的浓缩方法外，目前膜技术的发展已应用到酶蛋白的浓缩和

分离上来了，膜分离技术是以一定孔径的高分子膜作为过滤介质，将不同大

小、不同性状、物质颗粒或大分子进行分离的技术。

膜分离技术所使用的膜主要是由丙烯月青、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛

璐粉、尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分离过程中，膜的作用是

有选择性地小于其孔径的颗粒通过，将大的颗粒截留，根据欲分离的物质颗

粒的大小，选择不同孔径的膜。

根据物质颗粒通过膜的原理及和推动力的不同，膜分离技术可分为以下

三种：

①加压膜分离

加压膜分离是以膜两侧的流体静压差为动力，推动小于膜孔径的颗粒通

过膜孔，大于孔径的颗粒被截留。根据膜孔径大小范围又分为超滤、微滤和

反渗透三种。

超滤：即超过滤，本技术过滤截留的颗粒直径在20—2000A(0.2um)

相当于分子量1000—5Xl()5Da,并且有多种规格供选用。此法主要用于酶蛋

白的浓缩和部分纯化分离，止匕外，在生化药业也常被采用。

此技术采用的滤膜是由丙烯睛、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等高分

子聚合物制成的高分子膜，膜由两层构成，分表层和基层，表层是滤膜的有

效层，其厚度为0.1—5umum,孔径大小有多种规格，现有20—2000A的

系列产品销售；基层为支持层，主要负责膜的强度，其厚度为200—250口m

具有坚韧的强度。

影响超滤的因素：膜的过滤效果用膜的流率来表示，即每平方厘米膜每

分钟滤过的流体量，以ml./cm2.min表示，影响流率的主要因素有膜孔径的

大小、颗粒性状、溶液的黏度、流体静压。根据上述影响因素，可在一定范

围内增加流体静压(一般控制在50—700kPa)、适当提高溶液温度、增加溶

液的搅拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。

超滤技术在目前无论是实验室研究还是酶制剂的工业化生产应用都非

常广泛，其操作简单，工作效率高，但对于那些有小分子辅酶的酶制剂不宜

采用此技术。

25

微滤：又称微孔过滤，其孔径较超滤膜的孔径大，一般在0.2—2.0um

范围，主要用于过滤去除细菌及其它显微镜下可见的颗粒物质，此法在酶蛋

白的浓缩和分离方面不用，主要勇于矿泉水、无菌水、软饮料生产方面除菌

和除去不溶性颗粒物质。

反渗透：反渗透膜的孔径最小，一般在20A,截留分子量为1000D主要

用于分离各种离子和小分子物质，此技术主要用于生产纯水，海水的淡化等。

②电场膜分离：将膜分离装置置于电场下，被分离的物质在电场的作用

下，借助电场力作为推动力，以达到分离的目的。利用电场膜分离的物质，

必须具备一个基本条件，那就是其必须是带电粒子，如果其不带电荷，或其

静电荷为零，这样的粒子就不适宜用此法分离。常用的有以下两种方法：

电渗析：在一个电渗槽内，用两块半通透膜隔成三个室，中间室装待分

离液，两侧室装水或缓冲液，并装有电极，接通电源后，带正电荷的粒子向

负极渗透，而带负电荷的粒子向正极渗透，从而达到分离的目的。此法多用

于酶液的脱盐，去除杂质等。

离子交换膜电渗析：其装置与电荷风析一致，只是所用的膜较为特殊，

两块膜上带有带电基团，且电性相反，使得带相同电荷的粒子不能靠近膜，

不致于影响膜的通透性。其应用范围与电渗析一致，当溶液的浓度较高时一，

此法工作效率更高。

③扩散膜分离：

扩散膜分离主要是指透析方法，将酶溶液装在由扩散膜制成的透析袋

中，再将透析袋置于扩散介质（缓冲液）中，溶液中的小分子就通过膜扩散

出来，大分子被截留在袋内。此法主要用于没蛋白的脱盐；另外此法还可用

于酶蛋白的浓缩，当浓缩酶蛋白时，是用高浓度的吸水性较强的扩散介质，

常用的有甘油、聚乙二醇（粉剂）等。

2酶的提纯与精制

一般情况下，工业上用的大多是经过初步提纯的酶制剂，不需要进行高

度提纯和精制，但对于一种酶来讲，在其应用以前，我们必须弄清楚酶的有

关酶学特性，要研究酶的性质，需要将酶进一步提纯和精制。下面我们介绍

几种常用的提纯方法。

2.1离子交换层析法：

26

此法是利用离子交换剂上的可解离基团对各种极性粒子的亲合力不同，

而达到分离目的的方法。

按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子

交换剂两种，一般情况下，酶蛋白的等电点在pH7以下，所以在偏碱性溶

液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；对于有些酶蛋白等电点

较高，可以将其置于偏酸性溶液中，这样酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应

选用阳离子交换剂。目前常用的阴离子交换剂有：DEAE〜纤维素（二乙基

氨基乙基纤维素）、AE〜纤维素（氨基乙基纤维素）,DEAE〜SephadexA50；

阳离子交换剂有CM〜纤维素（竣甲基纤维素）。其中用的最多的是DEAD〜

纤维素和DEAE〜SephadexA50,DEAE〜纤维素适宜用来分离分子量在

10,000-100,000或以上的蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱

床体积基本保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附0.1-1.1毫克酶蛋白。

虽然DEAE〜SephadexA50的交换容量更大，（5.0毫克/克交换剂），但其

有一最大的局限性，就是在洗脱过程中，随着离子强度的增加柱床体积变小,

影响分离效果。

下面我们以DEAE〜纤维素为例介绍其基本操作要点：

①离子交换剂的处理：首先将DEAE〜纤维素用蒸储水浸泡溶涨，然后

按：0.5N盐酸处理30分钟以上（不断搅拌）一蒸储水反复洗涤致中性一0.5N

氢氧化钠处理30分钟（不断搅拌）一蒸储水洗涤致中性。

②洗脱液pH的确定：采用pH梯度测定。

③装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用倾倒法装柱。

④平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于洗脱流述，使流

出缓冲液的pH与流入的相同。

⑤上样：为达到良好的分离效果，上样量一般为其交换容量的10-20%,

样品的pH值和离子强度应与洗脱液一致。

⑥洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗脱下那些与交换剂

结合力很小或不结合的杂蛋白；然后，通过改变洗脱液的离子强度进行梯度

洗脱梯度洗脱公式为：

C=C2—（C2—C|）（1—v/V）A2/AI

C2：洗脱液的极限离子浓度；C,：初始离子浓度；V：洗脱液流出体积;

V：贮液室和混合室的总体积；A2：贮液室的截面积；A1；混合室的截面积;

当A2/A1等于1时，上述公式代表一个直线梯度变化；当小于1时，为凹形

梯度变化；当大于1时，为凸形梯度变化。

27

⑦分部收集：利用自动分部收集器收集。

⑧合并收集和浓缩：

2.2凝胶过滤层析

离子交换层析，是根据蛋白质所带静电荷的多少，其与交换剂的亲合力

不同，来将不同的蛋白质分开；但对于那些等电点较接近，所带静电荷接近

的蛋白质，利用离子交换的方法就无法分开。

凝胶过滤法是以不同蛋白质的分子量大小差异来将不同蛋白质分开的

方法。最常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex）,是由葡聚糖和3-1,2环氧化丙

烷（交联剂）相互交联而成的中央带有微孔的球状凝胶颗粒，根据凝胶分子

的交联程度的不同，共有SephadexGlO、G15、G25、G50、G75、G100>

G150、G200等8种型号，G50以下的为硬胶，G75以上的为软胶。G10的

交联度最高，分子内的网孔最小；G200的交联度最低，分子内网孔最大。

（1）凝胶过滤的基本原理：

（2）操作要点：

①凝胶的选择：

G25以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量在5000以下的小

肽。

G50主要用于分离分子量1500—30000的小分子蛋白。

G753000—80000o