基因打靶技术

基因打靶技术

基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰（包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等），并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。

基因打靶技术的概念基因打靶技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上。

同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中，相同或者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姐妹染色体间的断裂而产生新的重组片断。

干细胞是指一类具有无限分裂能力的细胞，他们能通过一次不对称分裂在复制自己的同时产生不同类型的细胞。胚胎干细胞是从着床前的哺乳类胎盘中分离的全能干细胞，具有在体外不分化的增殖能力，经过长期体外培养后仍然具有分化成所有3种胚层的发育潜能。基因打靶技术的原理

进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要导入靶细胞的靶载体。该载体不仅含有需要插入的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段，即同源重组指导序列。将此载体导入靶细胞，通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上。因此，同源重组是基因打靶技术的分子生物学基础。基因打靶的具体方法（一）首先要获得胚胎干细胞系；（二）构建基因打靶载体：把目的基因及其调控序列等与内源靶序列同源的序列，都重组到带有标记基因的载体上；（三）用电穿孔或显微注射等方法将打靶载体导入受体细胞内；（四）利用同源重组技术使修饰的目的基因定点重组到基因组中；（五）筛选获得带有研究者预先设计突变的中靶胚胎干细胞；（六）通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的胚胎干细胞引入受体胚胎内，经过遗传修饰的胚胎干细胞仍然保持分化全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞。使得经过修饰的遗传信息经生殖系统遗传，最终获得的带有特定修饰的突变体动物为研究者提供了一个特殊的研究体系，可以在生物活体中研究特定基因的功能。图1:基因打靶流程图基因打靶筛选系统

由于在真核细胞内发生同源重组的机率非常低，因此要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就成了基因打靶要解决的关键技术问题。1.正向选择法：

正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。其原理是：构建一个特殊的载体，此载体所携带的正向选择标记基因本身没有自己的表达调控因子，而只能利用靶位点上相应的表达调控元件来启动表达，从而发挥选择标记的作用。根据所用的表达调控元件的不同，此法又可分为无启动子筛选法和无Poly(A)筛选法。2.正负筛选法（positiveandnegativeselection,PNS）

这是目前最为常用的方法。正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Neo基因作为正选择标记；在同源序列之外的3’末端，或3’，5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶HSV–TK基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使载体线性化，然后导入细胞中，进行体外培养，并以药物G-418和GANC作双重筛选。图2：正负选择载体的筛选原理Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区；A、B：染色体上的两个基因E：外源基因；neo：G418抗性基因，即正选择基因；HSK-TK：负选择基因3.PCR筛选法

PCR法就是选择性地扩增发生同源重组的DNA片段。发生同源重组时，由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是DNA片段的拷贝数以指数形式增加，得到已知长度的DNA双链片段。与之相反的是，在随机整合中，由于只有一个引物且为单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链，长度不定。运用PCR法进行筛选时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费力。基因打靶效率的影响因素

基因打靶的效率可以用相对效率和绝对效率来表示。所谓绝对效率是指发生同源重组的细胞数与处理的细胞数之比；相对效率是指发生同源重组的细胞数与发生随机整合的细胞数之比。影响打靶效率的因素很多，归纳起来，主要有以下几种：

1同源片段来源及长度的影响2调控元件的影响3外源DNA导入方法的影响4靶基因位点的影响基因打靶技术的应用

1基因功能和基础理论研究方面新基因功能的研究是当前分子生物学蓬勃发展的一个重要领域。基因靶位操作技术通过定点改造基因组中特定基因，有可能在细胞水平上研究特定基因的功能和调控机制，从定点突变的干细胞获得突变基因型个体，而在生物体水平了解基因的胚胎发育和生理功能。定点突变细胞和基因突变型个体的获得，为阐明基因的功能提供了最直接的途径。2分子免疫方面可以利用基因打靶观察某一基因对免疫细胞发生发展的影响。有人利用干扰素调节因子1或2作为靶基因，打靶终止其活性后，导致了Ⅰ型干扰素的异常，并且致使淋巴细胞发育异常另外，还可以用基因打靶的方法去观察一些免疫机制。例如，Manjunath等用基因打靶技术破坏了CD43基因，结果提高了T淋巴细胞的粘附性，为进一步观察和探讨一些免疫机制奠定了基础。3在病理模型和基因治疗方面目前，越来越多的人类疾病被证实是由基因缺陷所致，人类疾病的动物模型对病理学研究和临床治疗都非常重要。自发或诱变病理模型需要漫长的时间；应用转基因技术，外源基因在基因组中的随机整合可能带来不确定的表型。而基因靶位操作技术在很大程度上克服了上述局限，它通过胚胎干细胞的体外转染、筛选和胚胎嵌合体途径，获得含特定突变基因的模型小鼠，得到多种病理模型。

基因靶位操作技术还为人类遗传疾病的基因治疗提供了有力手段。所谓基因治疗，即通过对缺陷基因的修复，使病灶细胞重新获得正常功能。靶位操作技术对缺陷基因结构进行精确改正，与功能弥补性基因治疗不同，修复后的细胞表达正常蛋白，不表达错误产物，因此它是一种理想的基因治疗策略。4转基因动植物和生物反应器方面

转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动植物体内，使外源基因与动植物本身的基因整合在一起，实现体内表达，从而培养出转基因动植物的技术。基因靶位操作技术的出现，使转基因动植物和生物反应器研制更为精确。如果应用基因打靶技术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中，定点改造原有基因的功能，使转基因动植物和生物反应器的研制更为精确。基因打靶技术的前景与展望基因打靶技术是80年后期发展起来的新兴的分子生物学技术。它具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点，是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法。这项技术无论在基础理论研究还是在实际应用中都有十分广阔的前景。