MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座

多位点可变数目串联重复序列（MLVA）分型技术和操作步骤

李伟中国CDC传染病所传染病预防控制国家重点试验室PulseNetChina第一期培训-06-19

1MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第1页病原菌分子分型目标长久研究病原菌遗传进化病原菌适应来自宿主高选择性压力因点突变、重组（包含基因转移）等遗传变异

短期研究了解病原菌适应性感染溯源2MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第2页分子分型方法序列或分类资料为基础等位基因：多位点序列分析（multilocussequencetyping，MLST）多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-LocusVariable-numbertandem-repeatAnalysis,MLVA）

图像分析：脉冲场凝胶电泳（PFGE)随机扩增多态性DNA分析（randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)扩增片断长度多态性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）核糖体分型（ribotyping）等3MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第3页MLST

结果无偏性unambiguousresults有对应数据库支持internationaldatabases区分度低，Lowdiscriminationpower高花费，highcost:sequencing不适合常规检测和暴发调查，unsuitableforroutinesurveillanceandepidemiologicalstudies4MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第4页VNTRVNTR：可变数目出那里重复序列，VariableNumberofTandemRepeats

AACTTTACGTTCAAATTAACGTTCAAATTAACGTTCAAATTTACCTTG

侧翼序列重复单元5MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第5页18bp*3AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGAVNTR产生原因：聚合酶滑链复制6MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第6页

100bp200bp

300bpGelmigrationStrainCDC1551:5x15bpStrainH37Rv:4x15bpstrainCDC1551:230bpstrainH37Rv:215bp230bp215bp200bpPCRprimers:CTCCCACACCCAGGACAC

CGGCCTACCCAACATTCCPCR215bp230bp

TRF软件（TandemRepeatsFindersoftware），://minisatellites.u-psud.fr/VNTR位点确实定测序分析7MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第7页VNTR和等位基因atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgatPrimer-F上游序列VNTR重复下游序列重复拷贝数=扩增大小-上下游序列重复单元大小Primer-R取整：就近取整或去除小数取整8MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第8页串联重复序列可变重复数目标判定9MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第9页MLVA方法多位点可变数目串联重复序列分析可变数目串联重复：VNTR：MLVA方法：即VNTR数组比如：MLVA1型735266210233136ST1++-MLVA1型别菌株血清型TR1TR2TR3TR4TR5TR6TR7TR8TR9MLST其它特征MLVA1410461531.719123026ST81---10MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第10页分析软件：BioNumerics

命名MLVA型：MT1-MT85评价各位点分辨力：Nei’sindex=1-Σ(allelefrequency)2

评价MLVA方法分辨力：

Simpson'sindex=1-Σ[nj(nj-1)]/[N(N-1)]聚类分析构建最小生成树11MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第11页MLVA试验操作一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板二、PCR扩增多重PCR反应三、扩增条带大小判断：（一）毛细管电泳：1.引物标识2.各种不一样荧光染料标识上游引物（FAM、HEX和TAMRA）3.ABI3730系统进行分析，用内标（ABI自带）（二）普通电泳分析（三）测序分析12MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第12页MLVA试验步骤-PCR2个PCR体系/多重PCR体系：体系（20ul）指标BufferdNTP上下游引物10uM（个ul）酶模板ulTm延伸时间循环数片段大小判断方式A1TR2-FAM2.01.50.20.3u0.756℃40秒30毛细管电泳TR4-HEX0.3A2TR1-FAM2.01.50.20.3u0.757℃40秒30毛细管电泳TR3-HEX0.3模板制备：DNA提取模板

水煮模板13MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第13页扩增条带大小判断：

（一）毛细管电泳：1.引物标识2.各种不一样荧光染料标识上游引物（FAM、HEX和TAMRA）3.ABI3730系统进行分析，用内标（ABI自带）（二）普通电泳分析（三）测序分析14MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第14页用500liz内标标定扩增片段大小用genemap软件分析毛细管电泳图用毛细管电泳来判断片段大小15MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第15页MLVA聚类分析Bionumerics软件（version4.64）效用均等分类资料分析方法（

UPGMA）(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages)

等分权重分类图/最小生成树形式展现多态性指数：Simpson’sindex

16MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第16页MLVA方法应用Neisseriameningitidis(23)

Streptococcuspneumoniae(20),Streptococcusuberis(12),

SalmonellaEnteritidis(10),

Salmonellaenterica(5,35),

Listeriamonocytogenes(28,29,39),

Legionellapneumophila(33),Clostridiumperfringens(37),Leptospirainterrogan(38,38),

EscherichiacoliO157:H7(30,46),

Clostridiumdifficile(43),Burkholderiapseudomallei(42),

Pseudomonasaeruginosa(32),Shigellaspp(13)et.al..

17MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第17页分型方法评价标准

区分度(discriminatorypower)数字化数据库适合试验室间比对（comparebetweenlaboratories）重复性（Reproducible）流行病学相关性（epidemiologicalconcordance）

方便快速（convenienceandrapidity）稳定性（stability）轻易解释（easytointerpret）花费技术难度18MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第18页MLVA方法好处上述优点含有弹性flexibility.不需要参考菌株作为参考19MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第19页第二部分发展一个新MLVA方法20MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第20页基于序列比较初筛多态性VNTR位点PCR判定和筛选核酸测序确定重复模式区分效能评价系统测试筛选多态性VNTR得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75%

选择出114位点现实模板扩筛选

33血清型和21个猪链球菌2型

36个电泳行为不一样确认重复序列和重复单元数14个确定指标9个指标MLVA策略21MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第21页TRF软件（TandemRepeatsFindersoftware）://minisatellites.u-psud.fr/串联重复判定匹配赋2分不匹配-3分碱基缺失-5分最小汇报分值50分以猪链球菌为例：判定了750,749,790,784测序菌株基因组串联重复位点比较菌株名称血清型起源ST型GZ12(CP000837)ST1P1/72(www.sanger.ac.uk)ST105ZYH332(NC_009442)ST798HAH122(NC_009443)ST7SC842ST722MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第22页串联重复判定23MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第23页串联重复判定IndicesPeriod

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NumberConsensus

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MatchesPercent

IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)1858865--1858900123.0127005236533251.791862974--1863158463.946784228222312401.891867321--1867363162.61670752252513341.9324MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第24页串联重复判定25MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第25页26MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第26页insertedasmallsegment

泳道1234567891011121314菌号SC22NJ2598029801GZ189-1591P1/7R735ATCC4376511611HASS-73SC061001SC0623806GZ115161718192021222324LN1GX2CQ1GZ2SC17SC8443800324380026RC4716Gx40727MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第27页28MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第28页各种重复模式IndicesPeriod

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NumberConsensus

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MatchesPercent

IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)217182--217298244.524611896271635211.94217182--217291158.114571877271735201.94217221--217313392.439941171251634231.95217185--217309129.712581487271634211.95TR229MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第29页第三部分MLVA方法在猪链球菌分型中应用30MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第30页猪链球菌暴发疫情年-四川人感染猪链球菌暴发疫情215人感染、39人死亡涉及四川36个县202个村庄

重庆，贵州，广东，江西也发觉病例江苏1998暴发疫情25感染/14死亡Yu,H.,H.Jing,Z.Chen,etal..HumanStreptococcussuisoutbreak,四川,China.Emerg.Infect.Dis.12:914-92031MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第31页中国猪链球菌PFGE型别SmaI酶切：ST7型分为单一PFGE-01型，年和年中国ST7菌株：PFGE-01型Ye,etal..Emerg.Infect.Dis.32MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第32页codeLocus§LocationinGZ1MatchesInGZ1%TandemrepeatsequenceTm℃Simpson’sindex%‡TR1SSTR135_111bp_445_3u135784..13622864CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTTATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA604.7TR2SSTR218_39bp_210_2.7u218682..21889194AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG588.2TR3SSTR1675_102bp_287_2u1675611..167589788CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG605.9TR4SSTR1260_90bp_928_7u1259913..26084084ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGAAAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA558.3TR5SSTR69_49bp_352_2u69283..6963489AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT605.9TR6SSTR928_30bp_172_2u927971..928142100CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT607.0TR7SSTR127_10bp_134_4u127866..12799996AAAATATAGA587.1TR8SSTR260_231bp_677_2u260573..26124980CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAAGAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAAAAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGACTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA5522.7TR9SSTR709_5bp_354_38u709802..710155100GAGCA5896.1猪链球菌MLVA指标和特征上游引物标识：FAM/HEX/TAMRA.多重PCRsM1和M2用毛细管电泳M3用普通电泳法TR1~8低或中等变异度指标TR9高变异度指标(value0.96).

33MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第33页指标等位基因型34MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第34页166株猪链球菌血清2型MLVA分型

35MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第35页36MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第36页37MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第37页年江西猪链疫情分析冷库搬运工：JX1冷库猪肉：Jxs1，Jxs2，Jxs3共同型别MLVA31.江西病猪起源于江苏1998年三株江苏菌株和年江苏菌株也为MLVA31型。38MLVA分型技术和实验操作步骤专家讲座第38页输入性人感染猪链球菌分析

年4月，泰国籍。我们试验室判定，分离菌株（W2886）血清2型，ST1型。TR1TR2TR3TR4