病原学诊断与防治

病原生物学教研室DepartmentofpathogenicBiologyofGannanMedicalUniversity医学微生物学MedicalMicrobiology1第八章病原学诊断与防治

第一节细菌学诊断第二节病毒学诊断第三节真菌学诊断第四节特异性预防与治疗(自学)

2第一节细菌学诊断细菌学诊断内容包括:

◙

查病原菌及其成分（抗原、产物、核酸）

——细菌学诊断（bacteriologicaldiagnosis）

◙查特异性抗体

——血清学诊断（serologicaldiagnosis）

3一、病原菌检测

（一）标本采集与送检原则◙按疾病种类与病程采取不同标本◙无菌操作，防污染◙在发病早期与用药之前采取标本

——对已使用抗菌药物的患者标本，实验室要采取适当措施

4◙快速、冷藏送检

——对少数菌要保温送检（如脑膜炎球菌、淋球菌等）◙有特殊要求的细菌（如某些严格厌氧菌等）必须在特殊条件下送检和保存。5（二）检测方法1、形态结构检查2、分离培养鉴定3、抗原检测4、其他检测61、形态结构检查一般程序：

标本涂片固定染色镜检（观察镜下特征：菌体形态、排列、染色性及特殊结构等）初步鉴定

注：对形态、结构、排列方式和染色性无特征的细菌，直接涂片染色镜检无意义

7主要技术（1）显微镜放大技术普通光学显微镜以可见光为光源分辨率：0.25μm

放大倍数：×10008

B.电子显微镜以电子流代替光波，电磁圈代替放大透镜分辨率：1nm

放大倍数：×10万以上电镜标本制作复杂，且必须真空干燥状态下观察

——不能观察活的微生物9C.其他显微镜:

适用不同观察目的暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜共聚焦显微镜10（2）染色技术细菌易与带正电荷的碱性染料结合而着色简单染色法：只用一种染料，过程简单，可观察菌体形态、排列方式复合染色法：用二种或二种以上染料多步骤染色，能反映菌体内部染色特征11革兰染色法：革兰阳性菌（紫色）、革兰阴性菌（红色）抗酸染色法：抗酸阳性菌（红色）、抗酸阴性菌（蓝色）特殊染色法：细菌荚膜、芽孢、鞭毛、细胞壁、核质等染色12革兰阳性菌(Grampositivebacteria)革兰阴性菌(Gramnegativebacteria)涂片结晶紫染色碘液媒染酒精脱色复红复染革兰氏染色法（GramStain）由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。1、步骤：13

2、分离培养与鉴定

（isolationandidentification）

一般程序：标本（或增菌后）接种普通琼脂平板血琼脂平板选择培养基平板培养特征：生长条件菌落特征溶血环特征等染色镜检：根据形态特征初步鉴定生化反应：如肠道杆菌的乳糖发酵试验14血清学鉴定：鉴定细菌的种、型毒力鉴定内、外毒素检测动物试验：家兔、豚鼠等药敏试验纸片法：只可定性试管法：可定量（测MBC、MIC）

E-test：可定量（只可测MIC）153、抗原检测（detectionofbacterialantigens）用已知Ab检测待测Ag：特点：特异性强、敏感性高，Ag的检出与病原菌的死活无关164、其他检测：代谢产物的检测：如气相色谱法鉴定厌氧细菌

PCR检测核酸基因芯片17二、血清学检测用已知Ag测未知Ab

标本：血清和其他体液诊断意义：双份血清Ab效价4倍及4倍以上升高18

凝集试验：

Widaltest——诊断伤寒、副伤寒

Well-Felix——诊断立克次体病钩体的显微凝集试验

中和试验：抗“O”试验

ELISA常用方法：19第二节病毒学诊断病毒感染的检测内容查病毒查特异性Ab病毒颗粒病毒抗原病毒核酸病毒酶类：如逆转录酶电镜直接观察光镜检查包含体分离培养20一、标本采集与送检原则◙按疾病种类与病程采取不同标本◙无菌操作，标本用“双抗”或加两性霉素B

处理◙在发病早期与用药之前采取标本◙低温保存，快速送检，病变组织用50％甘油保存◙血清学检测采双份血清

21二、病毒的分离与鉴定一般程序：标本无菌处理动物接种鸡胚培养细胞培养指标阳性指标阴性病毒鉴定盲传2－3代指标阴性病毒阴性22（一）病毒分离培养方法1、动物接种:

黑猩猩、猴、兔、鼠等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高、动物体内常带有潜伏病毒232、鸡胚培养:优点：易管理,不带微生物,成本较低缺点：操作程序复杂243.细胞培养(1)原代和次代细胞培养组织组织块分散的单个细胞单层细胞剪碎蛋白酶培养基(原代细胞)单层细胞(次代细胞培养)传代培养25病毒的细胞培养26

特点:

A.对多种病毒敏感

B.生长能力有限,获取成本高

C.可携带潜伏病毒27(2)二倍体细胞培养

体外分裂50-100代仍保持二倍体染色体数目。可用于病毒的分离和疫苗生产特点:

A.对多种病毒敏感

B.不带异种蛋白(人源性)C.不带病毒,无致瘤潜能

D.可传代50代左右28(3)传代细胞培养特点:A.对多种病毒敏感性高

B.繁殖能力高,传代时间长

C.有致癌危险，不能用于疫苗生产291.细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)Cytopathiceffectofenterovirus71andHSVincellculture:notetheballooningofcells.(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital,LindaStannard,UniversityofCapeTown)(二)病毒在细胞中增殖的指标病毒感染细胞发生形态改变30CytopathicEffectSyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).（2）病毒感染细胞与邻近细胞融合31（3）形成包涵体（inclusionbody）CytopathicEffect32Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.2.红细胞吸附（hemadsorption,HAd）病毒包膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受体333.干扰现象（interference）风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（－）埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚肾细胞风疹病毒？埃可病毒CPE(-)——风疹病毒(+)

埃可病毒(-)CPE(+)——风疹病毒(-)

埃可病毒(+)4.细胞代谢改变：病毒增殖，细胞代谢变慢，pH变化减慢34(三)病毒定量测定血凝试验：病毒总量（活病毒+死病毒）蚀斑测定（plaque）：ID50或TCID50(50%组织细胞感染量)：感染性病毒量35(一)标本的采集浅部感染真菌：表层皮损组织（用70％酒精消毒）深部感染真菌：体液、分泌物、排泄物等(二)检查与鉴定1、直接镜检：查孢子、菌丝表层角质标本：用10％KOH微加热后镜检体液、分泌物、排泄物：离心后染色镜检第三节真菌学诊断362、分离培养：标本处理大培养小培养菌落特征观察观察菌丝孢子特征鉴定生化反应或分子生物学技术沙氏培养基373.动物试验4.皮肤超敏反应试验（三）真菌学快速诊断检测真菌Ag、Ab检测真菌核酸检测真菌毒素38一、人工主动免疫

用人工的方法将疫苗或类毒素等抗原性制剂接种于人体，使机体获得特异性免疫力。用于预防。主要生物制品:死疫苗活疫苗类毒素基因工程疫苗转基因植物疫苗亚单位疫苗

DNA疫苗重组载体疫苗合成疫苗第四节特异性预防与治疗39死疫苗与活疫苗的比较区别点死疫苗活疫苗制剂特点死，强毒株活,无毒或弱毒株接种剂量与特点量较大，2~3次量较小，1次保存及有效期易保存，约1年不易保存，4℃

数周免疫效果较低，维持数月~2年较高，维持3~5年甚至更长40

用人工的方法注射含有特异性抗体的免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力。用于应急性预防和治疗。主要生物制品：抗毒素细胞免疫制剂抗菌血清胎盘球蛋白丙种球蛋白二、人工被动免疫41区别要点人工主动免疫人工被动免疫免疫物质抗原抗体或细胞因子等免疫出现时间慢，2~4周快，立即免疫维持时间长，数年~数月短，2~3周主要用途预防治疗或紧急预防人工主动免疫与人工被动免疫的比较42(一）抗菌药物的种类生物来源分类：细菌、真菌、放线菌产生的抗生素按化学结构和性质分类①β-内酰胺类④四环类②大环内酯类⑤氯霉素③氨基糖苷类⑥喹诺酮类、磺胺类三、细菌感染的治疗43影响细胞壁合成:β-内酰胺类抗生素等。影响细胞膜的功能：多黏菌素、两性霉素B等。影响蛋白质的合成：

①作用于核糖体30S亚基②作用于核糖体50S亚基影响核酸代谢（二）抗菌药物的主要作用机制44（一）抗病毒化学制剂1.核苷类似物：①无环鸟苷（阿昔洛伟）、丙氧鸟苷（庚昔洛伟）、喷昔洛伟：用于HSV感染引起的单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹。②阿糖腺苷：用于HSV、VZV、CMV、HBV感染及HSV引起的角膜炎。四、病毒感染的治疗45③病毒唑（3’-氮唑核苷）：用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗。④碘苷（疱疹净）：用于疱疹病毒引起的角膜炎。

⑤叠氮胸苷(Azidodeoxythymidine,AZT)、拉米夫啶：为HIV逆转录酶抑制剂。46①抑制病毒基因复制：

a.模拟核苷成分掺入病毒基因组；

b.竞争病毒复制酶。②抑制病毒基因转录。核苷类药物的作用机制：

472.非核苷类逆转录酶抑制剂：奈非雷平3．蛋白酶抑制剂：沙奎那韦瓦、英地那韦4．其他：金刚烷胺、乙基金刚烷胺。抑制病毒的穿入与脱壳。48干扰素干扰素诱生剂中草药IL-12、TNF等49反义寡核脱氧核酸（asODN）反义寡核苷酸（asON）核酶（ribozyme）siRNA（smallinterf