常用分子生物学技术RNA干扰技术省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

药学分子生物学张徐江苏大学医学院分子生物学及检验教研室xuzhang@1/39生物芯片（biochip）以生物、电子、机械和信息技术为基础，在固相支持物表面建立集成、连续、微型分析系统，形成芯片，实现对生物大分子准确、快速、高通量、自动化检测。2/39基因芯片（genechip）将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针，然后与标识待测核酸样品进行杂交，经过对探针杂交信号强度分析来获知样品中对应靶分子数量和序列信息。3/39基因芯片工作原理：核酸分子杂交1.芯片制备基因芯片检测步骤：2.样品准备和标识3.分子杂交4.信号检测5.数据处理分析4/39蛋白质芯片

（proteinchip）将蛋白质有序固定于载体上制备芯片，然后用标识蛋白质或其它成份与芯片作用，洗去未结合成份，再检测芯片上荧光强度，来分析蛋白质间或蛋白质与其它分子之间相互作用关系。5/39将不一样生物体组织标本按预先设计次序排列在固相载体上形成组织微阵列，是一个高通量、多样本分析工具。

组织芯片

（tissuemicroarray）6/39用人工方法测定并分析核酸碱基组成及排列次序，即测定核酸一级结构。第一代测序技术：链末端终止法

(Sanger法，双脱氧链终止法)核酸测序（sequencingofnucleicacids）7/39双脱氧链终止法测序以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，在测序引物引导下，DNA聚合酶介导体外合成互补DNA。双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP）为链终止子（4组1套反应），合成四组有序列梯度互补DNA。高分辨电泳分离新合成DNA，依据产物大小识读碱基排列次序，最终转换为待测模板核酸序列。基本原理8/39双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP)9/39测序模板序列5’TCAGCTCGAATC10/39第六章惯用分子生物学技术第一节聚合酶链反应第二节分子杂交技术第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术第五节基因组编辑技术第六节分子相互作用技术11/39RNA干扰技术双链RNA能高效、特异性地诱导同源mRNA降解，从而缄默基因表示，称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi），也称转录后基因缄默。1990年，在转基因牵牛花中观察到共抑制现象12/39RNA干扰（RNAinterference,RNAi）1998年，AndrewFire和CraigMelo首次将正义链和反义链RNA混合后，注入线虫（C.elegans），观察到更强基因表示抑制作用，据此提出RNA干扰概念。A.未染色组;B.正常对照组C.反义RNA组;D.正义+反义RNA组13/39

年，首次报道在哺乳动物细胞中，经过21个核苷酸大小siRNA诱导特异性基因缄默。14/39安德鲁·菲尔&克雷格·梅洛发觉“RNA干扰机制”，获年诺贝尔医学奖15/39RNA干扰机制（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）（2）RNA诱导缄默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成（3）RISC

活化：siRNA解旋成为单链，无活性RISC转变成活性形式（包含siRNA反义链）（4）诱导靶mRNA降解：在siRNA反义链引导下，RISC识别并切割与siRNA反义链互补靶mRNA（5）dsRNA再生成16/39RNA干扰机制17/39

siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由dsRNA裂解而成小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要参加抵抗外源性病毒核酸侵染。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）

miRNA（微小RNA）：约22nt，由miRNA前体剪切而成，可抑制mRNA翻译。miRNA主要参加内源性基因表示调整。18/3919/39siRNA(小干扰RNA)

miRNA(微小RNA)起源siRNA是外源性，是RNA干扰中间产物miRNA是内源性，是生物体固有结构siRNA是双链RNAmiRNA是单链RNADicer酶加工过程对称地起源于双链RNA不对称加工，仅剪切miRNA侧臂作用位置siRNA可作用于mRNA任何部位miRNA主要作用于mRNA

3′端非翻译区（3’-UTR）作用方式siRNA普通造成靶mRNA降解，即为转录水平后调控。miRNA可抑制靶mRNA翻译，也能够造成靶mRNA降解，即在转录后水平和翻译水平起作用作用阶段siRNA不参加生物生长，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要调整内源基因表示，在发育过程中起作用20/39RNA干扰技术实施策略1、体外合成siRNA采取化学合成法来直接合成靶向目标基因siRNA，再经过不一样方法导入细胞。2、siRNA表示载体介导依据siRNA序列设计DNA片段，插入表示载体中，导入细胞，转录出shRNA，深入切割形成siRNA。21/39体外合成siRNA22/39短发卡RNA（shRNA）siRNA表示载体介导正义链反义链--------CUGAGGUCACCAUUAGAUG-----------靶mRNA23/39RNA干扰技术特点1、RNA干扰技术优点（1）含有较高特异性（2）基因缄默效率较高2、RNA干扰技术缺点

“脱靶效应”（off-targeteffects）24/39RNA干扰技术应用2、基因治疗（基因失活性治疗）（1）病毒感染性疾病

经过RNAi抑制

RNA病毒复制1、基因功效研究（功效失活策略）（2）基因过表示引发疾病（如肿瘤）

siRNA药品“基因敲减（knockdown）”25/3926/39基因打靶（genetargeting）利用同源重组原理对细胞特定内源基因进行改造技术。27/3928/39基因敲除（geneknockout）：宿主基因组中特定功效基因部分片段被同源外源DNA片段替换，从而使靶基因失活。基因敲入（geneknockin）：外源功效基因与宿主基因组中同源序列进行同源重组，插入到基因组中，从而在细胞内取得表示。基因打靶（genetargeting）29/39基因敲除小鼠产生1.体外构建基因敲除载体：靶基因同源DNA序列+选择性标识基因2.将基因敲除载体导入ES细胞：显微注射法、电穿孔法等3.筛选、判定发生了同源重组ES细胞：标识筛选法、分子判定法4.将ES细胞导入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠子宫5.小鼠交配传代取得特定纯合基因型子代小鼠30/39Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出现显著体重增加现象31/39REGγ基因敲除鼠（下列图）出现脊椎弯曲等早衰现象32/39Gab1基因敲除造成小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺点（图示上半部分），主要是因为血管内皮细胞管状结构形成信号调控通路出现障碍而引发（图示下半部分）。33/39酪氨酸酶基因敲除后，原来是黑色小猪，变成了白色，表现出经典白化病特征。34/39基因编辑（geneediting）对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段敲除、加入等。

CRISPR/Cas系统：由CRISPR基因座与其串联Cas基因组成，经过序列特异RNA介导，切割降解DNA。35/39Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CR