重组DNA技术的基本工具（第一课时）课件【知识精讲精研】高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

是

基因的组成单位、空间结构、碱基互补配对方式相同

3.同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为

_所有生物共用一套遗传密码4.遗传信息的传递都遵循

中心法则复制

复制转录

翻译DNARNA蛋白质逆转录在另一种生物细胞内表达?1.棉花和苏云金杆菌的遗传物质都是DNA2.不同生物的DNA

分子能够拼接在一起，原因用到那些“分子工具”?这些“分子工具”各具有什么特征?思考：为何不同生物的DNA

分子能拼接起来，为何一种生物的基因可以HXH

7TAL1um苏云金杆菌怎么实现这一操作过程?转移?思考3:Bt

基因是否可以直接导入

到棉花细胞(受体细胞)?为什胞可能会被细胞中的酶降解或不能复制、表达。转录Bt基因转基因抗虫棉为什么能抗虫?目的基

因直接导入

受体细抗虫棉翻译mRNA,3*5”限制酶切割的是磷酸二酯键5*TGA)TCA磷酸二酯键3*C

3

G3'端有一个游离的羟基-OH;5'端有一个游离的磷酸基团。A

=T限制酶切割磷酸二酯键G

平面结构：5磷酸二酯键T

=具体结构磷酸二酯键s!4'5磷酸二酯键5'

3'=

T简化3'

5'磷酸二酯键5—AGTC—33—TCAG—5脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架是一样的简化G限制性内切核酸酶

P711

来源

主要从原核生物中分离纯化限制酶不是一种酶而是一类酶。2

种

类

数千种3

作用特点

专一性能够识别双链DNA

分子的特定核苷酸序列(一般都具有回文序列),

并且使每一条链中特定部位的磷酸二大肠杆菌的一种限制酶(EcoRD)能

识

别GAATTC序列，并在G

和A间切开限制酶G

AA

T

T

C|

|

|C

T

T

A

A

G限制酶切割的是什么?两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键氢，键目

动

断

开

芽能

够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，

步并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。酯键断开第

二限制性核酸内切酶的作用任务：1、请写出每种限制酶所能识别序列

2、

请根据教材所学内容，将上述序列限制酶切割位置，剪开并保留，上课另有用。3、

请判断切割后分别产生的是平末Sau3AHindIlBam

HITagl(*小

组

合

作

，

动

手

探

究端还是粘端，请写Hindll

重难点突破BamHISau3ATaql【

1AA.一个限制酶切割一次断_两

个磷酸二酯键形成_两个黏性末端

B.两个黏性末端增加了2

个游离的磷酸基团C.同一种限制酶切割形成的黏性末端相同D.有没有可能不是同一限制酶切割，也能产生相同的粘性末端?5*Sau3A酯

键GHindlllG5'3*BamHIC-T-A-G3*D.有没有可能不是同一限制酶切割，也能产生相同的粘性末有可能BamH!C-C-T-A-CSau3ASau3ABamHlp74.2、(2)

意义?同尾酶使构建载体时切割位点的选择范围扩大

。例如，选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因

的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限

制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。有可能，

识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶(不同的限制酶可能切

割形成相同的黏性末端，可以相互连接。)D.有没有可能不是同一限制酶切割，也能产生相同的粘性末端?p74.2、(1)

有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶Spel进行切割，

B片段分别用限制酶HindIl、Xbal、Ec

oRV和Xhol

进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。哪种限制酶切割B片段产生的DNA

片段能与限制酶Spel切割A片段产生

的DNA片段相连接?为什么?Xbal与Spel

切割产生了相同的黏性末端。SpeIHind

ⅢXbaI3'-TTCGAA-5'EcoRVXhoIE.这两种酶还能对新序列进行识别吗?不一定酶切位点

是否能识别新序列?一(两条新序列都不能)BamHI-新序列Sau3A资料卡限制酶名字的由来酶是从大肠杆菌

(Escherichia

coli)的

R型菌株分离来的，就用字母EcoR

表示；如果

它是从大肠杆菌R

型菌株中分离出来的第一

种限制酶，则进一步表示成EcoRI。Escherichiacoli属名(大写)

种名(小写)属名的头一个字母Serratia

marcescens属名(大写)

种名(小写)T、粘质沙雷氏菌中分离出来的第一种限制酶限制酶是如何命名的呢?是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组

成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是

从哪种生物中分离出来的。例如，

一种限制种加词的头两个字母Sma种加词的头两个字母R型菌株中分离出来的第一种限制酶EcoRI大肠杆菌的R

型菌株分离来的粘质沙雷氏菌又称灵杆菌属名的头一个字母含某种限制酶的细菌DNA

分子不具备这种限制酶的识别序列。或者DNA

分子经常被修饰(甲基化等),使限制酶不能将其切开。(表观遗传)限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA,

以保证自身安全。思考1:推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么?思考2:为什么限制酶不切割细菌本身的DNA

分子?思考·讨论基因进入受体细胞的载体—

“分子运输车”种类用途不同点质粒、噬菌体将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以

插入外源DNA片段的大

小也有很大差别植物病毒将外源基因导入植物细胞动物病毒将外源基因导入动物细胞三、

基因进入受体细胞的载体——

“分子运输车”1.作用：

①将外源基因送入受体细胞，②在受体细胞内对目的基因进行大量复制2.种类：质粒、噬

菌

体和动植物病毒等。最常用的载体——质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。拟

核DNA

质粒条件3:

有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA③目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉?条件4:

常有特殊的标记基因，

便于重组DNA

分子的筛选。如抗生素的抗性基因、荧光蛋白基因等。?

思考一下作为载体需具备的条件呢?

非常重要①假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有条件1:

能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA

上，

随受体DNA

同步复制。②作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样?外源的基因不可能插入片段(基因)插入其中。如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因的表达来检测。④如果载体对受体细胞有害将怎样?(霍乱弧菌质粒有许多酶切位点但不能用)将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的目的

基因也可能无法表达。复制原点

条件2:

须有启动子和终止子

(目的基因在插其之间)条件5:

易分离，对受体细胞无害。预想的效果吗?(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstI,而不选择SmaI。③为避免目的基因(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体和质粒的自身环化必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaI。和随意连接，也可

使用不同的限制酶

(

非

同

尾

酶

)

切(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限割目的基因和质制酶，如图甲中PstI;为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，粒

，如图甲也可选择用

Pstl

和

EcoRI也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst

I两种限制酶(但要和EcoRI

两种限制酶。确保质粒上也有这

两种酶的切点)。①应选择切割位点位于目的基医

两端的限制酶②不能选择切割位点位于目的基

因内部的限制酶非常重要(不需要填空，但必考大题)抄并理解如

何

选

定

限

制酶乙甲类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶大肠杆菌恢复磷酸一

开

七

红

中

自

日

性只能连接黏性末端T₄DNA连接酶T₄

噬菌体能连接黏性末端和平末端(效率较低)1.作用：将两个DNA

片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。注意：不是连接氢键(氢键的形成不需要酶的催化)。2.DNA

连接酶的种类：二、

DNA

连接酶——

“分子缝合针”DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质都能催化形成磷酸二酯键化学本质都是蛋白质不同

点模板不需要需要DNA的一条链作模板作用对象在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键作用结果形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制二、

DNA

连接酶——

“分子缝合针”5.比较DNA

连接酶与DNA

聚合酶*解旋酶：

断开氢键，解开DNA双链，形成两条脱氧核苷酸链。*DNA

连接酶：通过磷酸二酯键连接DNA片段。*DNA聚合酶：以DNA两条链为模板，能将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA子链。*DNA

酶：

断开磷酸二酯键，将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。*限制酶：断开磷酸二酯键，形成DNA片

段DNA

相关酶的比较3'活动1:模拟限制酶的剪切第一步：请小组合作运用EcoR1

限制酶(识别GAATTC序列，切割G和A之间)从苏云金杆菌的DNA上提取出Bt基SGGATCC

GAATTCTC……GCTATGAATTCCAAGCTTAC.Bt

毒蛋白基因3!CCTAGGCTTAAGAG……CGATACTTAAGGTTCGAATG.

5第二步：请继续用EcoRI

限制酶(识别GAATTC

序列，切割G和A之间)将某基因片段切开。1、黄色、绿色纸带：质粒了解单酶切有怎样的缺点?双酶切又有怎样的优势?·2、红色、蓝色纸带：含目

的基因的DNA

片段第三步：请将两者进行拼接。模拟制作——重组DNA

的构建·材料：·1、黄色纸带：质粒·2、红色纸带：含目的基因的DNA

片段·3、剪刀：限制酶(

EcoRI

)·4、透明胶带：DNA

连接酶重难点突破—载体需要具备的条件讨

论

分

析

，

合

作

学

习活动二：活动3:

优化酶切方案将同一种限制酶切割获得的目的基因与运载体混合后加入DNA

连接酶会出现的连接方式有：①目的基因自连②运载体自连③目的基因与运载体连接

所有还均有可能反向连接!④目的基因与目的基因连接⑤运载体与运载体连接用不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，以形成不同的末端，避免片段的任意连接重组DNA

的构建(改良后)·材料：●1、绿色纸带：质粒·2、蓝色纸带：含目的基因的DNA

片段

·3、剪刀：限制酶(

EcoRI、BamHI)●4、透明胶带：

DNA

连接酶重难点突破—载体需要具备的条件活动三：0Smal邕3e,(

8mw010sadraaha多s年OligooliqoBful

(BciVI)40sg

量MspI

EcoRIenovo分析表

永着轮期标准曲线物0Eco3110Eco91Io4X

awoolNeast)盟名CutSmart露oSmlobueiCutSamrt1408

d0o而

的T4

DNALigaseing1we*S?o它

3a0)IMIK慨

AahnfetBcul0uAart80.次意no8in58少DNA如何将DNA

提取出来，并进行鉴定呢?DNA(2)DNA

在不同浓度的NaCl溶

液中的溶解度不同，2.鉴DNA+

二苯胺利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性

当NaCl浓度为

2

mol/L时，

DNA的溶解度最大，浓度为(1)DNA

不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，利」0(

.14mol/

乙时，DNA

的溶解度1.提取DNA

的原理DNA

的粗提取与鉴定最

低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。一、实验原理与蛋白质。4molL

2mol/L

NaCl浓度沸水浴蓝色在一二、目的要求：1.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学

会DNA

粗提取的方法以及利用二苯胺试剂对DNA

进行鉴定。三

、材料用具：1.材料：

DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。(注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA

。)

鸡血是否可以?DNA

的粗提取与鉴定鸡血洋葱猪肝花菜香蕉菠菜②体积分数为95%的酒精

——

析出DNA③2mol/L

的NaCl

溶液

溶解DNA④二苯胺试剂

鉴定DNA,

要现配现用⑤蒸馏水SDS:使蛋白质变性与DNA分离；EDTA:是一种DNA

酶的抑制剂，

可防止细胞破碎后DNA

酶降解DNA;Tris:提供缓冲体系，DNA

在这个缓冲体系中呈稳定状态。研磨液、二苯胺的配制方法课本P1172.试剂：拓

展

了

解

-含有NaCl

、EDTA、SDS

、Tris

和HCl

材料用具①研磨液洗涤剂烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、剪刀DNA

的粗提取与鉴定取材、研磨结果观察分离过滤鉴定电子天平离心机1.研磨洋葱：

称取约30g,切碎，然后放入研钵中，倒入10mL

研磨液,充分研磨。2.过滤获取含DNA

的上清液：

上清液中除DNA之

外

，可能含有核蛋白、多糖等杂质直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min

的取

上清液放入烧杯中。抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA

降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；方案一：在漏斗中垫上纱布，将洋产冰箱中放置几分钟后，再取上清液取材、研磨四、方法步骤：目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中方案二：也转速下离心过滤到烧杯中，在4℃结果观察过滤取上清液分离鉴定过滤方案

一：在上清液中加入体积相等的、

预冷的酒精容液(体积分数为95%),静置2～3min,溶液中出现的白色丝状物

就

是粗提

取

的DNA

。用

玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；

减少DNA

断裂，以便获得较完整的DNA

分

子方案二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min

的转速下离心5min,

弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)

晾

干。低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。四、方法步骤：3.冷却酒精析出DNA鉴定取材、研磨用冷却的酒精析

出DNA结果观察分离过滤取两支20mL

的试管，各加入2

mol/L的NaC

溶液5mL。

将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中

各加入4mL的

二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。对照组如何设计?在等体积的NaCl

溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关4.DNA的鉴定：取材、研磨结果观察四、

方法步骤：过滤鉴定分离DNA的鉴定20:27

74%<DNA

粗提取与鉴定#高中生物实验华

+

计称取约5克洋葱Ⅱ

00:00/02:36弹

粥

发一条友好的弹乘吧16

3

倍速(1)选什么样的材料实验更易成功?用洋葱做材料，为什么要充分研磨?含DNA

的生物材料都可以，选取DNA

含量相对较高的生物组织，成功率更大充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。(2)猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA

的材料?操作时如何防止血液凝固?猪血(哺乳动物的成熟红细胞)无细胞核，不适合；鸡血中红细胞有核DNA,且

核DNA的量较多，适合。鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。(3)如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA

吗?加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。DNA

的粗提取与鉴定如果是猪肝呢?一、DNA

分子切割后的片段分析1、

对链状

DNA分子而言，若用限制酶完全切割后形成2个

DNA片段，则其上有1个酶切位点；若用限制酶完全切割后可形成3个

DNA

片

段

，

则

有

2

个酶切位点；以此类推。2、

对于环状

DNA

分子而言，若用限制酶完全切割后形成1个

DNA片段，则其上有1

个酶切位点；若用限制酶完全切割后可形成2个

DNA

片段，则有

2个酶切位点；以此类推。思考：

一

个链状DNA分子中有几个游离的磷酸基团，环状DNA分子呢?若

用限制酶将链状DNA分子切割后形成2个DNA片段，会产生几个游离的磷酸

基团，若切割后形成3个DNA片段，则又会产生几个游离的磷酸基团?拓展提升限制性内切核酸酶-

“分子手术刀”【思考】若某链状DNA

分子中含有两个BamHI

的识别序列，该DNA

分子将被切成

3

个片段，共断裂

4

个磷酸二酯键，形成几个

4

黏性末端。BamH

I—GGATCC——CCTAGG—限制酶a

限制酶b—AGATCT——GGATCC——TCTAGA—

—CCTAGG—酶a

酶b

酶a酶bB.

在

构

建

重

组

质

粒

时

，可

用口

目

的

基

因C.

成

功

导

入目的基因

的

大

肠的

培

养

基

中

生

长D.若

用

酶B和

酶C

切割

，可以化会

产

生

8

个

游

离

的酶A和

酶C

切

割

质粒

杆

菌

可

在

含

四

环

素

避

免

质

粒

的自身

环(

苄

青

霉

素

抗

性

基

因ApBR322启

动

子A.

图中

的质粒用磷酸

基

团某实验小组利

用如

图

所

示

质建

基

因

表

达

载

体

，将目的

基

月包并

表达

。

下列叙

述

正

确的海

CTB

目

的

基

因的

基

因

来

构大

肠

杆

菌

细)酶

B酶

AC四

环

素抗

性

基

因酶A切

割和

目导

入(D粒

因是后

，A判断正误1.通过基因工程产生的变异是不定向的

(X)2.限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(

X)3.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来

(

X

)4.E.coliDNA

连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(

X)5.限制酶和解旋酶的作用部位相同

(X)限

制

酶名

称识

别

序

列

和切

割

位

点限

制

酶名称识

别

序

列和切

害割位

点BamFIGGATCCK

pnIGGTAC

CEcoRIC*AATTCSau3AIGATCHindIGTY*RACSmaICCC*GGG注

：Y

为C

或

T,R

为

A

或

G。A.HindⅡ

、SmaI两种

限

制

酶

切

割

后

形

成

平

末

端B.Sau3AI

限

制

酶

的

切

割

位

点

在

识

别

序

列

的

外

部C.BamⅡ和Sau3AI