基因工程的基本操作程序课件

基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。（2）没有翻译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。基因的种类目的基因的获取基因工程的基本操作程序非编码区编码区下游终止子编码区上游与RNA聚合酶结合位点非编码区编码区启动子启动子：基因首端,与RNA聚合酶结合,起始转录。终止子：基因尾端,阻止RNA聚合酶移动，使转录终止。原核细胞的基因结构基因工程的基本操作程序能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构基因工程的基本操作程序(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成目的基因的获取基因工程的基本操作程序1.基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因种类部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库从基因文库中直接获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序（一）基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成与载体连接导入受体菌群mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库基因工程的基本操作程序1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因，又叫做体外DNA扩增技术。聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、原理：DNA复制利用PCR技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序4、条件：模板DNA(需含有目的基因)

四种脱氧核苷酸(dNTP)

热稳定DNA聚合酶(Taq酶）温度控制引物：与目的基因的起始段互补3、前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物PCR基因工程的基本操作程序IMN变性复性延伸PCR基因工程的基本操作程序5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1、变性(90---95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2、复性（55---60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3、延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、扩增过程PCR基因工程的基本操作程序PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成_______

b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的______________________延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链5′端→3′端基因工程的基本操作程序DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成

当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。DNA合成仪化学方法人工合成基因工程的基本操作程序1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——

核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA基因工程的基本操作程序基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。基因工程的基本操作程序

科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:基因工程的基本操作程序基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因基因工程的基本操作程序基因工程载体的构建需要考虑哪些因素

（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。基因工程的基本操作程序植物细胞：农杆菌转化法；基因枪法；花粉管通道法动物细胞：显微注射法；微生物：Ca2+处理法。将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序农杆菌转化法——采用最多农杆菌特点：感染双子叶植物和裸子植物；其Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体的DNA上。过程：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达受体细胞（植物细胞）基因工程的基本操作程序基因枪法——单子叶常用利用压缩气体产生的动力，将金属颗粒打入受体细胞，其表面包裹有表达载体DNA，进而目的基因与受体细胞基因整合并表达。基因工程的基本操作程序

花粉管通道法——中国独创，抗虫棉花粉形成的花粉管还未融合前，剪去柱头，滴加DNA，使目的基因借助花粉管进入受体细胞。基因工程的基本操作程序显微注射法过程：将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射胚胎发育获得具有新性状的个体受体细胞（动物细胞）基因工程的基本操作程序Ca2+处理过程：Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA受体细胞（微生物细胞）基因工程的基本操作程序目的基因的检测与鉴定检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性检测:分子水平是否插入目的基因——DNA水平是否转录——RNA水平是否翻译——蛋白质水平鉴定:个体水平

抗性、天然活性基因工程的基本操作程序检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质分子水平的检测——分子杂交技术探针DNA——DNA探针DNA——RNA抗原——抗体目的基因(DNA，Pr)