分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】

1-分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1965年S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。1970年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1978年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1981年R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。1982年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983年获得第一例转基因植物。1984年斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986年GMO首次在环境中释放。1989年DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--"Oncomouse"。1996年完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997年英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2001年完成第一个人类基因组全序列测定。2004年中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2、如何理解PCR扩增的原理及过程？答：（1）PCR的基本原理首先将双链DNA在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，然后以单链DNA为模板，并利用反应物中的四种脱氧核苷酸合成新的DNA互补链。（2）PCR的基本过程加入模板DNA，PCR引物，四种核苷酸，即适当浓度Mg，DNA聚合酶，经过;1.变性（Denaturation）：将待扩增的DNA模板加热变性成两条单链；2.退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；3.延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。3、简述定量PCR的原理和过程？答：（1）利用荧光测量的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的积累速力绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数问题。（2）反应在带透明盖的塑料管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的激发光被激发，荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能被激发发出荧光，随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上得荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加。在这一过程中利用荧光测量的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的积累速力绘制动态变化图。4、基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么?答：构建原理上的区别：真核基因组文库的构建是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆clone。汇集这些文库，应包含基因组中的各种DNA顺序，每种顺序至少有一种代表，这样的克隆片段的总汇就成为基因组文库。cDNA文库的构建：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体即cDNA文库。用途上的区别：DNA基因库广泛用于细菌，真菌等基因组较小的物种的研究，及基因组作图，测序和克隆序列的对比。cDNA基因库可用于筛选基因，大规模测序，基因芯片杂交等功能基因组学研究。5、基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的原理和用途。答：基因克隆(genecloning)：又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。基因克隆的方法：RACE技术，cDNA差示分析法克隆基因，Gateway大规模克隆技术，基因的图位克隆法。【3’RACE的原理】（1）加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；（2)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。（3)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。【5’RACE的原理】5’RACE与3’RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录mRNA获得第一链(-)cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行PCR扩增。【cDNA差示分析法原理及用途】通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。经过2～3次的重复后，T群体中的非特异性序列几乎被清除。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得cDNA片段的纯度高。用途：在没有任何探针的情况下，用于克隆控制某一特定性状或者生理反应中间步骤的基因。【Gateway大规模克隆技术原理及用途】Gateway技术利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。【基因的图位克隆法原理及用途】用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。6、在基因操作实验中有哪些检测核酸和蛋白质相对分子质量的方法？答：定时定量PCR技术，核酸凝胶电泳技术。7、蛋白质组学的研究对象和目的是什么？需要有哪些技术和方法？答：蛋白质组学致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达以得到全部蛋白质表达图谱。需要的技术有：蛋白质分离技术（双向电泳技术，蛋白质印记法，蛋白质质谱分析技术和高效液相色谱技术）及鉴定技术（现代质谱）。8、SNP作为三代遗传标记的优点是什么？答：SNP标记的主要特点有：1、SNP数量多，分布广泛。据估计，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。2、SNP具有更高的遗传稳定性3、SNP具有代表性，更易于基因分型。4、SNP适于快速、规模化筛查。但是成本太高，开发有限（专利问题），SNP数量多，难以选定用哪个SNP解决复杂的遗传问题，并对数据进行有效的分析。9、基因分型的方法有哪些？简述其原理。答：基因分型是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究。主要包括：基因芯片技术，TaqMan技术，分子信标技术和焦磷酸测序法。基因芯片技术原理：主要涵盖了一个固相的核酸序列，作为他的靶点而以一种或多种标记的样本，也就是说探针与芯片进行杂交，还有一个检测系统开进行定量检测，基因芯片的基本原理也就是利用基因互补配对的原则，在一个载体上来进行基因检测，实际上是一个高密度的杂交技术。TaqMan技术原理：PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。分子信标技术原理：分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：环状区、茎干区、荧光基团和淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而，分子信标的荧光几乎100%恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。焦磷酸测序法原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底