蛋白质工程提高蛋白质稳定性的研究进展

PAGE1蛋白质工程提高蛋白质稳定性的研究进展摘要：提高蛋白质的稳定性已经成为生物学以及蛋白质工程领域的研究热点。蛋白质工程的基本目标是按预期的结构和功能，通过分子设计和DNA重组技术对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。在蛋白质工程的研究中，提高蛋白质稳定性是一个重要目标。本文具体阐述了蛋白质不稳定的原因、提高蛋白质稳定性的途径以及目前的一些方法，着重讲了蛋白质工程技术中的理性设计。最后对现阶段关于提高蛋白质稳定性的研究进行了总结。关键词：蛋白质工程；蛋白质；稳定性Abstract:Ithasalreadybeenaresearchhotpotinthebiologyandproteinengineeringtoimprovethestabilityoftheprotein.ThebasicgoalofproteinengineeringistoproduceaproteinwhichisbetterthanthenatureproteinthroughthemoleculardesignandDNArecombinationtechnology,basedontheexpectedstructureandfunction.Thenewproteinismoreinthelinewiththehumansociety’sneeds.Inthispaper,thereasonswhichleadtoprotein’sinstability,thewaystoimprovethestabilityofprotein,andtheprocessintheproteinstabilityresearcharedetailedlypresented.Andtheemphasisisontherationaldesign.Intheend,thepresentresearchinimprovingthestabilityofproteinissummarized.Keywords:proteinengineering;protein;stability前言蛋白质工程是以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，所以只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能通过改变氨基酸达到改造蛋白质的目的。蛋白质有很多生物学特性，其多种多样的生物学功能与其特定的空间构象密切相关，当蛋白质的构象发生变化时，会使其功能活性也随之改变。对于蛋白质而言，其稳定性是非常重要的。因此，蛋白质工程在维持蛋白质稳定性上起到了至关重要的作用[1]。目前对许多蛋白，如T4溶菌酶和芽孢杆菌RNA酶已有系统研究，揭示了影响稳定性的一些重要结构因素。并用于改善重要的工业用酶的稳定性。随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结构与功能研究的突破。特别是PCR技术的进一步成熟，DNA改组技术更加成熟．使得DNA改组成为蛋白质体外分子进化的主流技术。DNA改组或家族改组是通过单个基因或多个家族基因产生同源重组的突变库．并结合有效的筛选策略获得具有目标性状的蛋白。DNA改组技术具有许多重要优点。例如不需要事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变体的方法。1影响蛋白质稳定性的因素1.1疏水相互作用在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象被称为疏水相互作用。疏水相互作用并不是疏水基团之间的吸引力，而是疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近。疏水相互作用主要影响蛋白质的构象熵，是蛋白质三级结构的形成和稳定中最重要的一个因素[2]。1.2氢键氢键是指氢供体和氢受体的之间距离不超过3A，并且氢供体与氢受体之间的夹角小于90o时形成的非共价键。氢供体与氢受体广泛存在于蛋白质的主链、侧链以及蛋白质周围的水分子中，因此在多肽链内以及蛋白质与周围的水介质之间都可以形成氢键。在蛋白质内部形成一个氢键所获得平均能量约为0.6kcaL/mol[3]。1.3离子键带有相反电荷的氨基酸残基之间的静电力称为离子键或盐键(ionicbond)，离子键对蛋白质的热稳定性具有非常重要的作用阳。Das等[4]系统比较了12个物种的基因组(其中4个嗜热古细菌、1个嗜热细菌、1个真核生物、6个中温细菌)，发现在嗜热菌中的蛋白质以及蛋白质的α-螺旋区含有的三种带电荷的氨基酸(主要是Glu、Lys和Arg)的数量要明显高于中温菌。这些增加的带电荷氨基酸可以在螺旋内部或是在螺旋之间形成更多的盐键，这对于维系嗜热蛋白质的稳定性起到非常关键的作用。1.4芳香环的相互作用芳香环相互作用主要包括阳离子和芳香环(cation-π)之间以及芳香环与芳香环之间的相互作用。Cation-π相互作用主要是带正电荷离子与芳香环的相互作用，这种相互作用较离子键的能量要高两倍。研究表明，超过70％的精氨酸残基的侧链附近都有芳香族氨基酸的侧链存在，而位于蛋白质表面的色氨酸有大约30％都与阳离子有相互作用[5]。通过系统比较900个中温蛋白质以及300个嗜热蛋白质的三维结构发现，嗜热蛋白质结构中cation-π键出现的频率要远远高于中温蛋白质[6]，这种相互作用可以提高蛋白质对热的适应性。芳香环与芳香环之间的相互作用是指两个芳香类氨基酸(Trp、Tyr以及Phe)苯环中心的距离不超过7.0A时产生的相互作用，通常这些芳香类氨基酸包埋或部分包埋在蛋白质的疏水核心，对蛋白质的热稳定性会产生重要的影响[5]。1.5二硫键二硫键(disulfidebond)可通过降低蛋白质解折叠状态的熵值来达到稳定蛋白质结构的目的，也是影响蛋白质热稳定性的关键因素。利用突变技术在酶分子中的合适位置引入二硫键可以显著提高蛋白质的热稳定性。如利用软件DisulfidebyDesign在来源于Rhizomucormiehei的脂肪酶的第96及106位氨基酸处设计了一个二硫键，使该酶的半衰期延长了2～4.8倍[7]。2提高蛋白质稳定性的基本途径2.1填充疏水内核疏水侧链的内埋使其屏蔽于溶剂分子．是蛋白质折叠的驱动力和构象稳定的重要因素。天然蛋白质的疏水内核虽然是密集的．但也常常有空隙存在。过去在对Barnase的研究中发现，通过定位突变技术在疏水内核中引入空隙。使得酶分子的稳定性显著降低。反之。通过减少疏水内核的空隙，可以提高蛋白质的稳定性。然而疏水效应在影响分子稳定性的同时．主链张力所产生的能量对稳定性也有显著作用．因此，通过这种途径稳定蛋白质需要同时兼顾这两种作用。实际上，从目前来看．这种方法虽在理论上具有可行性。但是实践中效果并不显著。甚至有许多困难[8]。2.2减少非折叠的构象通过引进二硫键，替换Gly，增加Pro，达到减少非折叠构象的目的。蛋白质非折叠构象的数量越大，折叠成单一天然态所消耗的焓越高，因此减少非折叠构象的数量可以提高蛋白质的稳定性。其中最有效的方法是引入二硫键。引入的半胱氨酸之间的环链越长，非折叠结构受到的约束就越强，结构也越稳定。但是，通过蛋白质工程途径引进二硫键时，不能简单、随意地选取在空间上相近的2个残基位置，必须分析它们是否符合形成张力-S-S-键的条件。例如在T4溶菌酶中引入二硫键，可显著提高其热稳定性。将Gly突变成其它氨基酸或增加蛋白质的数量，是减少非折叠构象以提高稳定性的又一条有效途径。这主要是因为Gly没有侧链。所以具有比其它氨基酸残基更大的构象自由度。脯氨酸的侧链共价固定在主链上。具有比其它残基更少的自由度，因而对稳定蛋白质构象有非常重要的作用。对于突变位置必须严格选择．避免引起折叠构象中的主链构象变化或破坏已有的侧链相互作用。值得注意的是。这种通过突变引起熵变的效应是加和性的，许多这种突变的联合效应会显著增加一个蛋白质的稳定性。2.3蛋白质表面和表面静电相互作用有学者研究表明。蛋白质的表面和表面静电对于蛋白质的稳定性具有重要的影响。静电相互作用的大网络存在以及较高的低聚体的存在被推测是有利于蛋白质的稳定性，这是因为在许多嗜极端条件的酶上发现了这个现象。2.4稳定α螺旋α螺旋作为一个偶极子在N端带正电荷，而在C端带负电荷，通过残基替换来稳定α螺旋偶极子，是提高蛋白质稳定性的又一条有效途径。3蛋白质工程提高蛋白质稳定性的方法蛋白质的热稳定性是蛋白质在生物催化过程中执行许多新功能性质的先决条件。许多蛋白质工程方法被应用于提高蛋白质稳定性的设计中。目前提高蛋白质稳定性的方法主要有理性设计和组合设计。3.1理性设计提高蛋白质热稳定性所谓蛋白质理性设计是基于对蛋白质结构和功能关系的认识，通过定点饱和突变技术改造蛋白质的一种方法。进行蛋白质的理性设计意味着在突变之前，人们需要进行仔细的考虑与推测，选择特定位点进行突变。该个方法通常要求有蛋白质三维结构，并且要求对蛋白质的催化机理、结构和功能的关系以及酶的热稳定性机制有深入的了解。由于人的理性参与，可以在较短的时间内设计并得到性质改善的突变体。理性设计获得的结果可以反过来扩充人们对于蛋白质结构和功能的认识。但是由于目前人们对酶的催化机制以及酶热稳定性机制的认识有限，理性设计的应用范围受到很大的限制。到现在为止应用比较成功的方法主要有以下几种：3.1.1蛋白质表面电荷的优化策略蛋白质通常是在内部形成一个疏水核心，而在其表面分布着一些带电荷的氨基酸，这些分布在蛋白质表面的带电荷氨基酸之间可以通过电荷之间的相互作用，给蛋白质形成一个保护网，增加蛋白质对高温的抗性。因此通常可以通过对蛋白质表面带电荷的氨基酸进行重新设计优化，使其表面的电荷分布更加合理，从而提高其热稳定性。3.1.2同源比对的策略研究发现，在嗜热蛋白质与其同源的中温蛋白质之间往往具有较高的相似性(通常可达到40％～80％)[9]，因此，可以通过比较热稳定性高的蛋白质与热稳定差的蛋白质的序列，找出与热稳定性相关的氨基酸位点，然后对其进行突变，进而可以提高中温蛋白质的热稳定性。3.1.3基于二硫键的设计策略在蛋白质特定位置上的二硫键可以对蛋白质的热稳定性起到至关重要的作用。它主要通过降低蛋白质解折叠状态的熵值来达到稳定蛋白质结构的目的。3.1.4温度因子的策略温度因子(B-factor)的概念起源于晶体研究，主要是用来体现晶体中原子构象状态的一种“模糊度”(diffusion)。这个“模糊度”实际上反映了蛋白质分子在晶体中的构象状态。B-factor越高，“模糊度”越大，相应部位的构象就越不稳定或柔性越强。在晶体学数据中，B-factor一般是以原子为单位给出的，通常我们将其换算成相应氨基酸残基的B-factor，从而可以分析氨基酸残基的构象稳定性或其柔性。研究发现，将蛋白质结构中B-factor值较高的氨基酸突变后，部分突变体的热稳定性可以得到明显的提高。因此有些研究也利用机器学习算法来预测B-factor，从而辅助突变位点的设计。3.1.5脯氨酸效应的设计策略脯氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸中非常特殊的一个，它包含一个亚氨基、一个羧基及一个吡咯烷环侧链。由于其N原子位于吡咯烷环上，使得Cα-N单键不能旋转，因而不可能形成仅α-螺旋所需的ψ角，加上脯氨酸没有N-H基，其侧链又阻止自身C=0基接近主链骨架的N-H基，不能生成维持α-螺旋构象所需的氢键，因此脯氨酸是α-螺旋的最大破坏者。在多肽链中，脯氨酸不仅限制自身的(ψ，Ψ)值，也限制前一个氨基酸的(ψ，Ψ)值。脯氨酸的N-Cα旋转受到吡咯烷环的束缚，因而具有更小的构象自由度，且限定其前面氨基酸只有有限的构象空间，这说明脯氨酸的引入可以降低蛋白质去折叠时的骨架熵，即增加蛋白质的刚性。与脯氨酸相对应的氨基酸为甘氨酸，由于该氨基酸没有侧链，具有灵活构象，它的(ψ，Ψ)值有较大的选择范围，可增加蛋白质的柔性。因此有研究表明，在蛋白质构象不稳定的区段如β-转角或无规卷曲中引入脯氨酸，可以提高蛋白质热稳定性。3.1.6基于蛋白质解析折叠自由能的设计策略蛋白质解折叠自由能(ΔGu)是蛋白质热动力学参数中最重要的参数，也是反应蛋白质热稳定性的一个通用指标，因此许多关于蛋白质热稳定性的研究都是利用生物信息学的方法来模拟突变对蛋白质解折叠自由能(ΔGu)的影响，即ΔΔGu.当ΔΔGu的值大于零时，表明该突变对蛋白质的热稳定性有正效应，反之有负效应。其中ΔΔGu的数据主要是来自于ProTherm数据库.3.2组合设计提高蛋白质稳定性组合设计是通过一种策略使得在基因水平上产生差异化，同时需要大量的高通量筛选来鉴别设计是否成功。其目标是在于通过在蛋白质随机微点引入随机突变来提高蛋白质的稳定性。组合设计相较于理性设计的优点在于不需要详细的蛋白质残基信息和知识，但是，从大量的组合产生的变异体集合中，有效鉴别稳定性提升的蛋白质是极为重要的，因为鉴别筛选工作非常的重要。组合设计方法又称为分子进化，是一种非理性设计方法。其需要配以高通量筛选技术和选择方法定向选择出稳定性提高的蛋白质，从而体现该方法的有适合特点。利用组合设计方法，配以荧光检测仪、圆二色谱分析、DSC等检测仪器，获得精确的蛋白质去折叠曲线，从而考察蛋白质的稳定性。通过应用选择方法，组合容错PCR技术和DNA改组技术，Hecky等[10]将β-内酰胺酶的最适温度从35℃提高到65℃。有文献报道，用该方法对酯酶进行定向进化，经6个循环突变，Tm值增加14℃以上。4蛋白质工程技术提高蛋白质稳定性研究进展4.1环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性的研究环糊精葡萄糖基转移酶是由芽孢类细菌产生的一类酶，主要出现在杆状细菌中。是一种重要的环糊精生产工业用酶，该转移酶能进行环化、偶合、歧化、水解4种反应。环糊精广泛的用于食品、医药、化妆品、农业和化学工业等生产领域，为了提高环糊精的产量，需要环糊精葡萄糖基转移酶具有更高的热稳定性。傅毅等[11]首先使用分子动力学模拟研究环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性，以补充实验上不易获得的原子能级和时间相关的信息。使用同源建模方法构建环糊精葡萄糖基转移酶及其突变体的三维结构，研究氨基酸的突变对环糊精葡萄糖基转移酶耐热性的影响，用CHARMM能量计算环糊精葡萄糖基转移酶及其突变体的能量与酶蛋白热稳定性之间的关系。实验结果证明基酸残基经过突变，突变型比野生型含带电残基更多。相应的，在蛋白天然结构中突变型环糊精葡萄糖基转移酶中，盐桥数量增加了10％。这些电荷之间、非极性残基之间的非共价键作用力的增强，提高了突变体的刚性，降低了突变体蛋白质分子的总能量，最后增加突变体蛋白质的耐热性。此外，傅毅等[12]在2012年采用分子动力学模拟取样研究了环糊精葡萄糖基转移酶的N-端环状区域中氢键与盐桥对其耐热性的影响作用，得到的结果说明在蛋白质环糊精葡萄糖基转移酶中合适的位置增加带电氨基酸数量，增强电荷间静电相互作用，对于提高环糊精葡萄糖基转移酶的热稳定性是有效的。4.2内含肽介导的蛋白质环化提高蛋白质稳定性的研究内含肽介导的蛋白质主链骨架环化是一种稳定蛋白质的新方法。在内含肽的作用下，蛋白质的N端和C端生成一个天然的肽键，达到蛋白质环化的目的。环化可以减小蛋白质构象的熵值，从而使蛋白质更加稳定。1999年Scott等[13]使用DnaE内含肽在体内环化了大肠杆菌的二氢叶酸还原酶和有8个氨基酸的酪氨酶抑制子川狼毒素F。环化了的二氢叶酸还原酶在体外展现出了更高的热稳定性和对蛋白酶的抗性；川狼毒素F则在体内实现了环化，并且它可以抑制重组的酪氨酶。同年，Andreas等成功地在体外环化了β内酰胺酶，骨架的环化提高了此酶的稳定性。4.3W544F定点突变提高苏云金杆菌CrylAc蛋白的稳定性的研究W544是CrylAc蛋白上独特于其它Cry类蛋白的一个氨基酸，它与F578和F604一起组成一个“螺旋桨状”的疏水簇，通过疏水相互作用维持蛋白的三维结构稳定。王发祥等[14]通过定点突变将W544保守地替换为苯丙氨酸，SDS—PAGE分析结果表明其纯化的原毒素对紫外照射、胰蛋白酶处理和室温存贮的稳定性相对于野生CrylAe都有一定程度的提高；经原子力显微镜观察，发现W544F产生的晶体两个顶点间的垂直距离比野生型CrylAc约长0.6μm，且晶体表面不及野生型光滑；此外，W544F与野生CrylAc的杀虫活性相似，但经过紫外光照射9h后，其保留的杀虫活性比野生型高4倍以上。W544F突变较好地解决了CrylAe毒素蛋白在田间应用的不稳定性问题。4.4定点突变技术提高植酸酶的稳定性有学者对E.colipH12.5酸性磷酸酶进行定点突变，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽链中的几个氨基酸残基，增加酶分子潜在的糖基化位点的数目。突变体基因在P.pastoris中表达，得到了糖基化程度、酶活性及热稳定性改变很大的突变体植酸酶。近年来的研究也表明，单一氨基酸的替换可以改变酶蛋白的热稳定性，尤其是蛋白质残基对改善热稳定性的作用尤为显著。5结语影响蛋白质稳定性的因素非常复杂，通过研究蛋白质结构与功能之间的关系，特别是三维结构对于稳定性的关系，采用蛋白质工程对天然蛋白质进行突变改造，以期获得目标稳定性。通过蛋白质设计方法对突变体进行筛选，获得高表达的突变体，生产适合工业化应用的高稳定性蛋白质。目前，相关的研究正在进行中。然而，尽管文章中所提到的一些蛋白质工程技术方法在提高一些蛋白质的稳定性上得到了成功的应用，但是由于影响蛋白质热稳定性的因素多且复杂，加之现阶段蛋白质热稳定性的相关数据很少，且蛋白质的热稳定性和其活性的最适温度之间的关系又是一个大问题。因此，蛋白质稳定性的研究仍然是现代计算生物学家及蛋白质工程学家努力的方向。参考文献[1]汪世华.蛋白质工程[M].北京：科学出版社，2008.[2]BeheraRK，MazumdarS.ThermodynamicbasisofthethermostabilityofCYPl75A1fromThermusthermophilus[J].Int..J.Bio1.Macromo1.,2010,46(4).[3]陈路清,张秀艳,唐彦捷等.嗜热酶的稳定机制和稳定策略的研究进展[J].科技通报,2008,6.[4]DosR，GemteinM．Thestabilityofthermophilicproteins：astudybasedoncomprehensivegenomecomparison[J]．Funct．Integr．Genomics，2000，l(1).[5]KorkegianA，BlackME，BakerD，eta1．．Computationalthermostabilizationofallenzyme[J]．Science，2005，308(5723).[6]ChakravartyS，VaradarajanR．Elucidationoffactobresponsibleforenhancedthermalstabilityofproteins：astructuralgenomicsbasedstudy[J]．Biochemistry(Mosc)．，2002，41(25).[7]HanZL，HanSY，ZhengSP，etu1．．EnhancingthermostabilityofaRhizomucormieheilipasebyengineeringadisulfidebondanddisplayingontheyeastcellsurface[J].Appl．Microbi01．Biotechn01．，2009，85(1).[8]王大成．蛋白质工程[M]．北京：科学出版社，2001．[9]AckermanSH．GattiDL，ThecontributionofcocvolvingresiduestothestabilityofKDO8Psynt