免疫组织化学检验技术（免疫学检验课件）

酶免疫组织化学检验技术

酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。一、标本制作常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片酶免组织化学检验技术可分为

酶标记抗体免疫组织化学染色法

非标记抗体酶免疫组织化学染色法二、酶标记抗体的免疫组化染色法（一）原理

酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。（二）技术类型

1.直接法形成抗原一抗体一酶复合物2.间接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物3.酶标抗体三步染色法为间接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物（三）方法评价三、非标记抗体酶免疫组化染色法（一）原理该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。（二）技术类型1.酶桥法

用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色2.PAP法即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶（P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP3.双桥PAP法

该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。4.APAAP法APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。（三）方法评价该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。四、临床应用

酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。

亲和组织化学检验技术

亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、SPA与IgG、链霉亲和素与生物素等。一、生物素-亲和素法生物素又称维生素H的小分子物质，常从卵黄和肝组织中提取。生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素也称抗生物素、卵白素，从卵白蛋白中提取的，每个亲和素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。常用的技术类型有：1.标记亲和素-生物素法（LAB法）将亲和素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。2.桥连亲和素-生物素法（BAB法）先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。3.亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法（ABC法）此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。

二、SPA法SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等的IgGFc结合的能力，这种结合不会影响抗体的活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。三、链霉亲和素—生物素技术链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和