酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序

酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节 间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、 纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、 以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、 置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、 PBST洗三次；5、 每孔200ulPBS/NCS4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、 每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、 37（度）孵育2h9、 PBST洗5次，每次5min10、 每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、 37（度）孵育2h12、 PBST洗5次，每次数5分钟；13、 每孔加OPD或TMBS底物100ul14、 37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1为阳性(2)P≥N+3SD为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。二、用全菌抗原的ELISA法（一） GA法1、 新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、 酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1MNaHCO495ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、 蒸馏水洗5次;4、 加细菌悬浮液,50ul/孔;5、 37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、 加PBS/NCS220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、 以下步骤同一。（二） MA法1、 细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；2、 室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分钟；3、 加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；5、 以下步骤同一成功范例：H单抗检测等。三、用全细胞抗原的ELISA1、 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液；2、 加100ul/孔细胞悬殊浮液于酶标板内，使每孔含细胞5X10（）3、 将板离心1000rpm10分钟，甩去上清，室温干燥（可保存在4℃或—20℃备用）；4、 PBST冼3次，每次5分钟；5、 每孔加100ul第一抗体或杂交瘤上清，设立对照；6、 37℃1—2小时；7、 PBST洗3次；8、 每孔加入100ul酶标第二抗体，37℃1—2小时；9、 PBST冼5次；10、 每孔加入100ul底绶冲液，室温作用30分钟；11、 判定结果。成功范例：粘附素单抗，O抗原单抗检测等。注意：若需要，可灭活细胞内源酶，以减少本底反应。其它方法参见本章第六节。第二节 直接ELISA1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方阵试验确定）包被标板（50—100ul/孔）；2、PBS/NCS封闭板（保存备用）；3、 每孔加50—100ul酶标抗菌素体；设立阴性、阳性对照；4、 37℃孵育2h5、 PBST洗5次，每次5分钟；6、 以下同间接ELISA；成功范例：沙门氏菌检验、抗血清效价测定、酶标抗体效价测定等。第三节 夹心ELISA试验1、 单一或混合单抗腹水或纯化的免疫血清用包被液稀释后25—100ug/ml；（有人使用蒸馏水直接稀释腹水作包被）。2、 以50—100ul/孔量加入酶标板中；3、 置4℃过夜吸附或37℃吸附3h4、 PBST洗3次；5、 PBS/NCS封闭，200ul/孔，4℃过夜或37℃3h；6、 PBST洗涤5次，每次1min；（可于—20℃保存备用）；7、 每孔加50—100ul待检抗原，同时设立阴、阳性对照；8、 37℃孵育2h；9、 PBST洗5次，每次5min；10、 每孔加50—100ul酶标单抗或酶标纯化抗体；11、 37℃孵育2h；12、 PBST洗5次，每次5分钟；13、 37℃孵育2h14、 PBST洗5次，每次5min；15、以下步骤同前。成功范例：鸡新城疫病毒，大肠杆菌，沙门氏菌检测。第四节 竞争ELISA试验1可溶性抗原以包被液稀释至1ug/ml（需方阵滴定确定），（全菌抗原包被方法参见前述）；2、50—100ul/孔，包被酶标扳；3、4℃过夜吸附；4、PBST洗3次。每次5分钟；5、PBS/NCS封闭200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存备用）；6、PBST洗3次，每次5分钟（可—20℃或4℃保存备用）；7、 加50—100ul/孔待检血清样品，再加入50—100ul/孔单抗，设立对照；8、 37℃孵育1—2h；9、 PBST洗5次，每次5分钟；10、 每孔加OPD50—100ul；11、 37℃避光作用10—20min；12、 以100ul/孔加2MH2SO4终止反应，测定OD490；13、 判定结果：（1） 抑制率（N—P/N）》50%判为阳性；（2） OD490值《NCXⅩ0.3+PCXX0.7为阳性(PCX为阳性对照的平均值,NCX为阴性对照的平均值)。成功范例：检测伤寒、鸡白痢抗体等。第五节 Dot—ELISA1、 根据实验要求不同，选用硝酸纤维膜，混合膜或醋酸膜，并切成条带，以硬模压痕迹；2、 以蒸馏水或TBS浸泡膜条带，取出晾干后备用；3、 抗原包被：（1）、可溶性抗原（ug/ul），每点点加5ul，37℃烘干；（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每点点加5ul；37℃烘干，可先将条带经5%GA处理后，37℃3h或4℃过夜，再加样烘干。4、 TBS/NCS或BSA封闭；5、 漂洗；6、 将膜转入酶标抗体内，37℃0.5-2h;(间接法步骤是:先于第一抗体中浸染漂洗后，转入酶标第二抗体中反应)。7、 漂洗；8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中显色，室温10—30分钟；9、 漂洗；10、 晾干后，判读结果（可以进行扫描分析）。成功范例：脂多糖抗原检测，大肠杆菌检测，单克隆抗菌素体筛选等。第六节 酶标组化法1、 抗原准备：（1） 细胞涂片：（2） 病变组织触片或冰冻切片；（3） 生长细胞的培养孔或玻片；2、 4℃丙酮固定10分钟；3、 灭活内源酶：将待检玻片浸入内源酶灭活液内，或于培养孔内加入内源酶灭活液，室温灭活30分钟，弃去灭活液，以PBS和去离子水充分洗涤10—20分钟，自然干燥；4、 以PBS/NCS封闭，37℃2小时或4℃过夜；5、 酶染：加酶标抗体反应（或间接法步骤进行）37℃1—2小时，并设立对照；6、 PBS洗15分钟表；7、 以DAB显色，室温避光30分钟；8、 镜检：细胞浆呈棕黄色，细胞核无色，阴性对照无色，判为阳性。（4—氯—1—萘酚显色）。成功范例：猪瘟组化法诊断。第七节 ELISA常用溶液的配方一、 包被液1、 碳酸盐绶冲液0.2MNa2CO3:12g无水Na2CO3+100ml去离子水0.2MNaHCO3：1.68gNaHCO3+100ml去离子水取0.2MNaCO3：8ml，0.2MNaHCO3:17ml混合再加75ml去离子水,调PH至9.6。2、 Tris—HCL绶冲液（PH6.0,0.02M）0.1NTris100mｌ0.1NHCL58.4ml培养离子水加至1000ml(TrisMW121.14)3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，请参阅有亲章节和文献。二、稀释和封闭液1、 EPBA（PH7.2）NaCL80gNa2HPO4.12H2O14.5gKCL2gKH2PO42g去离子水10升2、 EPBS/Tween—20/NCS：EPBS+0.05%Tween—20+10%NCSor！%BSA3、Tris—HCL绶冲液PH7.00.01M0.1MTris50.0ml0.1NHCL46.5mlNaCL8.5gBSA50g正常山羊血清150ml檬酸:去离子水1000ml三、洗涤液1、 EPBS/Tween—20EPBS+0.05%Tween—20（或80）2、 Tris—HCL/TweenPH7.40.02M1.0MTris20ml1.0NHCL15ml1.0NHCL15ml调PH至7.4Tween—2.00.5mlDW加至于1000ml四、底物溶液1、 磷酸盐—柠檬酸绶冲液（NO.1）0.1M柠檬酸:10.5gC6H6O7.H2O+DDW500ml0.2MNa2HPO4.12H2O+DDW1000ml取24.3ml0.1M柠檬酸、25、7ml0.2MNaHPO4再加50mlDDW注:柠檬酸溶液及配成的底物绶冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。2、 OPD（邻苯二胺）底物NO.1底物绶冲液10mlOPD4mg3%H2O240ul3、 TMBS（四甲联苯胺硫酸盐）TMBS贮液：10mg/mlDMSO4℃避光存放。TMBS贮液100ulNO.1底物绶冲液10ml1%H2O225ul4、0.05MPH7.6Tris_—HCL缓冲液0.1MTris50ml0.1NHCL38.5mlDW至100ml5、TBSbuffer（NO.220MmTrisbase500MmNacLadjustedtoPH7.5WithHCL6、 DAB（二氧基苯胺盐酸）底物DAB75mgNO.2底物绶冲液100ml避光搅拌3小时,使其溶解,滤纸过滤.临用前加1%H2O20.5ml7、4—氯—1—萘酚底物（4CN） (1)4CN贮液：3mg4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；(2)使用液：2ml4CN贮液+10mlTSbuffer+H2O2至0.01%(V/V)7、 酶反应终止液2mH2SO4浓H2SO410ml溶于80mlDW六、内源酶灭活液：0.01%H2O2,NaN,PH7.60.05MTris—HCL绶冲液：取PH7.50.05MTris—HCL绶冲液98ml，加1%H2O21ml1%NaN1ml即成。第八节 酶标抗体的制备一、 1、试剂1、 0.1MNaHCO3：0.84gNaHCO3+DDW100ml2、 0.1MNa2CO3：1.06gNa2CO3-DDW100ml3、 EPBS：同第七节4、 10mMNaIO4204.0mgNaIO4+DDW100ml5、 0.1mMNaOH6、 5mg/mlNaBH4：0.1gNaBH4+0.1mMNaOH20ml二、 HRP直接标记腹水中单抗1、 5mgHRP溶于0.5ml0.1MNaHCO32、 加0.5ml10mMNaIO4，混匀，盖紧瓶塞3、 室温（20℃）避光作用2h4、 加0.75ml0.1MNaCO3，混匀5、 加0.75ml小鼠腹水，混匀6、 用少许PBS将交联物转移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中7、 加SephadexG15或50干粉0.5g，混匀。盖紧，室温作用（避光）3h8、 用少许PBS将交联物全部洗出9、 收集洗出液，加1/20V新鲜配置的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟10、 再加3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1h或4℃过夜11、 将交联物过SephdexG200或Sepharose6B（2.5*50cm）层析纯化，分管收集第一峰12、 酶结合物质量鉴定：（1） 克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD403*0.4Ig量（mg/ml）=（OD280-OD403*0.3）*0.62酶结合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量标记率=OD403/OD280E/P值为1-2之间合格（2） 特异性及效价