饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测

1饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测本标准规定了饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测方法。本标准适用于含有益微生物丁酸梭菌的各种饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备T/CSWSL006-2019饲料添加剂丁酸梭菌3稀释液、培养基及试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。3.10.85%灭菌生理盐水。3.2丁酸梭菌培养基：见附录A中的A.1。3.3革兰氏染色液：见附录A中的A.2。3.4细菌生化鉴定试剂盒。3.5细菌基因组DNA提取试剂盒。3.6标准菌株：丁酸梭菌CICC10390。4设备和玻璃器皿除常用微生物实验室设备外，其他设备和玻璃器皿如下。4.1恒温培养箱：37℃±1℃。4.2漩涡震荡器：0~2800rmp/min。4.3显微镜：1000倍。24.4无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒。4.5无菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。4.6玻璃或塑料涂布棒。4.7天平：感量为0.1g、0.01g、0.0001g。4.84℃冰箱。4.9pH计：精确度0.1。4.10量筒：250mL。4.11PCR仪。4.12电泳仪。4.13凝胶成像仪。5检验程序丁酸梭菌检验程序见下图。36采样实验室样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是无菌器皿。采样后，样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。7试样的制备按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应及时检验。8操作步骤8.1检样制备以无菌操作称取试样25g(mL)，注入盛有225mL0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，均质1min～2灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1：100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做进一步的10倍系列递增稀释的稀释度。8.2接种和培养选择2个～3个适宜稀释度，每个梯度3个平行，用无菌移液器分别吸取0.1mL稀释液，接种到改良FTG培养基上。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，室温中放置15min，使菌液浸入培养基，倒置于37℃士1℃培养箱中培养24h士1h。8.3菌落计数培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。培养后的平板内的培养基颜色由粉色变成淡黄色，说明厌氧培养环境符合丁酸梭菌的培养要求。典型丁酸梭菌菌落形态呈圆形，直径1mm～3mm，白色，稍凸，不透明，形状不规则。9确证试验9.1概述目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。9.2菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃士1℃严格厌氧培养24h士1h，从平板上选取至少5个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。9.3形态观察4自平板上挑取典型单菌落，做革兰氏染色（附录A.2）镜检。丁酸梭菌革兰氏阳性，显微镜观测菌9.4生理生化确认试验将挑选纯化的单一菌落，用生化鉴定试剂盒或者生化鉴定管或者微生物鉴定仪按说明进行鉴定试验。丁酸梭菌生理生化特征见表1。表1丁酸梭菌生理生化特征+++—++——+—9.5PCR确证试验9.5.1DNA提取9.5.2扩增引物序列预计扩增产物大小为171bp。9.5.3PCR反应反应体系见表2。5表2PCR反应体系513程序设定如下：①预变性：95℃5min；②变性：95℃30s；③退火：55℃30s④延伸：72℃30s；⑤保温：4℃10min。步骤②至④的循环数设为35。9.5.4电泳用电泳缓冲液(1×TAE)制备1.0%琼脂糖凝胶，加入Gelred染料。取5μLPCR扩增产物，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳30min，电泳检测结果用凝胶成像仪记录并保存。9.5.5确证结果当阳性对照孔出现171bp扩增带，阴性对照孔未出现目的条带时,试验结果成立。被检样品出现171bp扩增带，丁酸梭菌阳性；未出现相应扩增带的样品判为阴性。10结果计算与报告10.1结果计算丁酸梭菌活菌数（CFU/g（mL=菌落平均数×稀释倍数10.2菌落计数只计算符合8.3的菌落。菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定，根据证实为丁酸梭菌菌落数计算出该皿内的菌数，然后乘其稀释倍数即得每g（mL）样品中的菌数，按式（1）计算：式中：A—测定的丁酸梭菌菌落数，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落总数。C—5个鉴定的菌落中确认为丁酸梭菌的菌落数。f—稀释倍数。6示例：含有丁酸梭菌的试料中106稀释液在培养基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为丁酸梭菌的是4个，1g饲料中含丁酸梭菌菌数为：7培养基和试剂A.1改良FTG培养基A.1.1成分胰蛋白胨15g酵母粉5g葡萄糖10g硫代乙醇酸钠3gL-半胱氨酸盐酸盐0.5g氯化钠2.5g琼脂20g刃天青0.001g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，调pH值至7.0±0.2，加热煮沸，121℃高压灭菌15min。A.2革兰氏染色A.2.1结晶紫染色液A.2.1.1成分结晶紫95%乙醇1%草酸铵水溶液A.2.1.2制法20mL80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2革兰氏碘液A.2.2.1成分碘碘化钾蒸馏水A.2.2.2制法300mL将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2.3沙黄复染液A.2.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mLA.2.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4染色法8将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗；滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。9细菌DNA提取B.1细菌DNA提取步骤B.1.1细菌培养细菌接种于5mL液体培养基中，37℃摇床（300rpm/min）培养过夜。B.1.2细菌收集取1mL培养物于1.5mL无菌EP管中，室温8000rpm/min离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mLTE（pH8.0）中或用ddH2O。B.1.3菌体裂解的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃过夜（此时菌液