3.2基因工程的基本操作程序++课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章第二节

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药使用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。问题：你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要那些步骤？3.将目的基因导入受体细胞苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建4.目的基因的检测与鉴定原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图目的基因的筛选与获取原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码1.基因的结构编码区：编码蛋白质的合成非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达包括：编码区上游编码区下游原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图目的基因的筛选与获取1.基因的结构启动子：RNA聚合酶结合位点，

转录起始的信号终止子：终止RNA的合成外显子：内含子：能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码序列=非编码区+内含子

真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图

【思考1】：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？成熟mRNA相应酶去除内含子转录翻译真核基因：编码区（外显子+内含子）多肽链前体mRNA蛋白质加工一般不能产生原来的蛋白质①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）目的基因的筛选与获取【思考2】:如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质？去除内含子成熟mRNA转录真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA相应酶mRNA单链提取逆转录酶DNA单链DNA双链酶把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA目的基因的筛选与获取2.目的基因的概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法目的基因获取方法人工合成从基因文库中获取利用PCR获取和扩增目的基因如何获取目的基因？（1）人工合成DNA合成仪前提：基因比较小、核苷酸序列已知方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法

（化学合成法、逆转录法）目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法（2）从基因文库中获取基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。建立基因组文库某生物所有DNA特定的限制酶基因组所有基因每个基因和载体结合重组DNA分子导入受体菌基因组文库建立cDNA基因文库某种生物的成熟mRNA单链DNA双链DNA片段（cDNA）导入受体菌中储存cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶与载体连接目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法（3）利用PCR获取和扩增目的基因概念：PCR全称为聚合酶链式反应，在生物体外，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。原理：

DNA半保留复制（体外）复习：DNA半保留复制的过程，观看视频，总结条件与特点条件原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的两条链酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP复制原则碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）特点半保留复制、边解旋边复制思考：结合体内DNA复制过程，思考进行PCR需要哪些条件？目的基因的筛选与获取复制方向子链的5’--3’端思考：结合体内DNA复制过程，思考进行PCR需要哪些条件？目的基因的筛选与获取体内复制在DNA复制中的作用体外复制解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸高温DNA母链四种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法（3）利用PCR获取和扩增目的基因条件:缓冲液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。目的基因的筛选与获取3.筛选与获取目的基因的方法（3）利用PCR获取和扩增目的基因5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物23’5’5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’引物13’5’引物23’5’引物25’3’引物1目的基因过程：变性→复性→延伸总结：PCR技术扩增过程a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成

。

b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部

。c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的

在

的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的新的DNA链，子链方向为

。氢键单链DNA双链结构4种脱氧核苷酸5′端→3′端耐高温的DNA聚合酶利用PCR获取和扩增目的基因（常用）反应的结果：以_______方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）

指数2n采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳第一次循环90℃以上，DNA双链解开50℃左右，引物与DNA结合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循环5’3’5’5’3’5’高温变性、低温复性中温延伸第二次循环3’5’高温变性、低温复性第三次循环3’5’中温延伸第三次循环3’5’比较PCR技术与体内DNA复制项目PCR技术体内DNA复制不同点场所解旋方式酶引物特点能量温度条件结果细胞外（主要在PCR仪内）细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶催化DNA在高温下变性解旋解旋酶、DNA聚合酶小段RNA或单链DNA分子一小段RNA体外迅速扩增生物体内边解旋边复制dNTPATP在较高温度下进行细胞内温和的条件短时间形成大量DNA片段形成完整的DNA分子第三章第二节

基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建（核心）1.基因表达载体的作用1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；2.使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。人们所需要的基因基因的尾端（一段特殊的DNA片断）终止mRNA的转录DNA复制所需结构3.基因表达载体的构建过程（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。（2）用_____________切断目的基因，使其产生_________________。（3）再加入适量___________，将切下的目的基因片段插入质粒的______处，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏性末端基因表达载体的构建【思考1】使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接11’22’122’1’22’1’1基因表达载体的构建【思考2】如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切EcoRⅠEcoRⅠBglⅡ防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化基因表达载体的构建第三章第二节

基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞1、

转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。将目的基因导入受体细胞2.转化的方法：导入植物细胞导入动物细胞导入原核细胞花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法、病毒介导法Ca2+处理法（感受态法）Ca2+转化法（导入微生物）使用Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）过程微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入受体细胞操作程序：取受精卵显微注射胚胎移植为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。显微注射法（导入动物细胞）将目的基因导入受体细胞病毒介导法（主要用于导入动物细胞）

科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。将目的基因导入受体细胞花粉管通道法（我国独创）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；适用生物：开花植物将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞农杆菌细胞内含有的

Ti质粒上的

T-DNA可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体DNA上两次拼接两次转化受体细胞的选择：①转基因植物用

；②转基因动物用

(一般不能用体细胞)；

原因是：

。③微生物常用

等。微生物作为受体细胞的优点是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为

，原因是

；⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是

。真核细胞分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工受精卵有发育的全能性无核，无器，不能合成蛋白质体细胞(叶、芽、根)或受精卵受精卵大肠杆菌、酵母菌繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作第三章第二节

基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测与鉴定类型检测内容方法检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出mRNA鉴定目的基因是否翻译形成蛋白质PCR扩增DNA分子杂交技术PCR扩增分子杂交技术抗原-抗体杂交技术目的基因的检测与鉴定【拓展】基因探针（1）定义：（2）特点：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。（3）核酸杂交：可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增DNA半保留复制原理：基本思路：1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；2.提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：目的基因的检测与鉴定②.检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术基本思路：1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA(cDNA)片段（