农业部饲料工业中心MAFIC

Alternativesofantibioticsforpigs猪用抗生素的替代DefaLi

李德发MinistryofAgricultureFeedIndustryCentre

农业部饲料工业中心2006年11月30日于北京猪营养

营养需要与代谢分子生物学WhooperatesMAFICResearch植物提取物免疫学微生物学分析化学营养与免疫基因工程菌细胞生物学

分子营养与肉品质团队研究Antibiotics抗生素Residue残留Resistance耐药性Harmfultoanimalandhumanhealth影响动物和人类的健康Reducetheuseofantibiotics减少抗生素的使用EU欧盟China中国Currentsituationandfuturedevelopment现状与展望Alternativesofantibiotics

抗生素替代Antimicrobialpeptides

抗菌肽

Herbalextracts

天然提取物Enzymepreparations

酶制剂Probiotics

益生素Probiotics

益生素Lactobacillus乳酸杆菌Mechanism机理研究Application应用研究绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白组学粘附位点无抗发酵饲料蛋白差异复合发酵培养悉生动物模型信号传导作用机制Targetingdistribution

目的细菌在肠道中的定位分布情况，其与肠道菌系之间的关系Specificpasswayandfunction

具体作用途径与功能的研究Experimentalmodelof

gnotobiotic

animals

悉生动物实验模型悉生动物（已知菌动物）空白组益生菌致病菌益生菌+致病菌Developmentofantibiotics-freefermentedfeed

无抗发酵饲料的开发

Fermentativerespiratorymembrane发酵呼吸膜Singlewayvalve

单向阀门CO2venting,preventingairtoenter

排出袋内微生物产生的CO2，阻止大气进入A,E.coliK88

大肠杆菌K88B,E.coliK99

大肠杆菌K99C,S.typhimurium

鼠伤寒沙门氏菌D,Staph.Aureus

金黄色葡萄球菌Int.J.Gener.Mol.Microbiol.,X.H.Guo,DefaLi,2006InhibitoryactivityofBacillusspp.139againstpathogenicbacteria,butnotLactobacillus外源芽孢杆菌可抑制有害菌，对乳酸菌无影响Multi-strainscombination,creatinganaerobicconditionautomatically多菌种组合，自身创造厌氧环境Yeast酵母菌Bacillusspp.芽胞杆菌好氧兼性兼性Lactobacillusreproduction

in

anaerobiccondition乳酸杆菌厌氧发酵Oligosaccharide寡糖NSPenzyme非淀粉多糖酶Activator激活剂

刺激ActivateInoculating,packing,thenfermentation先接种、包装，后发酵接菌激活剂原料发酵轻工业副产物：玉米浆、果渣Effectoffermentationtimeonenergyandgossypol能量与游离棉酚随发酵时间的变化Decreasethecontentofgossypol

降低游离棉酚的含量Fermentationtime(h)EnergyGossypolGossypol（mg/kg）Energy（kcal/g）Effectsofantibiotics-freefermentedfeedongrowthperformanceinpigs无抗发酵饲料对猪生产性能的影响P>0.05RFID

systemRFID追溯系统

基因芯片Genechip

：Theonlineexaminationtechniqueofantibiotics

基因芯片：快速检测分割肉中的抗生素含量（20-100ppb）Proteomics

蛋白质组学ProteomicsanalysisofinteractionbetweenLactobacillusandintestine

乳酸杆菌和肠道细胞相互作用的蛋白质组学研究J.Nutr.,J.J.Wang,DefaLi,2006蛋白质组学双向电泳样品制备数据库比对鉴定蛋白相互作用机制生物功能差异蛋白质谱分析图像分析胶内酶切蛋白Lactobacillus乳酸杆菌Intestinalepithelialcells肠道上皮细胞等点聚焦SDSExperimentaldesign

试验设计IntestinalcellsAdheredornotLactobacillusfermentumI5007cellsCulturemedium,37ºC

37ºC温箱4hRabbitjejunum兔子空肠Two-dimensionalgelelectrophoresis

双向电泳37ºC1hMassspectrometry

质谱Differentialproteins差异蛋白Lactobacillusin

rabbitjejunumculture兔子空肠培养条件下乳酸杆菌表达差异的蛋白Electrophoresis,

F.Yang,DefaLi,2006Glycosidehydrolase糖苷水解酶（粘蛋白的分解酶）降解肠粘膜表达的粘蛋白有利于乳酸杆菌粘附定植Fructose-6-phosphatePhosphoketolase(F6PPK)

6-磷酸果糖磷酸酮酶Lactatedehydrogenase乳酸脱氢酶Dihydrolipomidedehydrogenase二氢硫辛酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶系）糖酵解三羧酸循环磷酸戊糖途径减少氧自由基产生NADPH生成增加有利于乳酸杆菌存活IntestinalcellsafterLactobacillusadhesion肠细胞被乳酸杆菌粘附条件下表达差异的蛋白Electrophoresis,

F.Yang,DefaLi,2006Voltage-dependentanionchannel1电压依从性阴离子通道1Glutathionetransferase谷胱甘肽转移酶Heatshockproteingp96热应激蛋白gp96调控膜通透性改善机体免疫减少氧化应激改善肠道完整性及其健康

Synbiotics

合生素

Functionalmechanismof

synbiotics

合生素的作用机理Synbiotics

合生素Bacillussubtilis枯草芽孢杆菌Astragalus,aloepolysaccharide,etc.黄芪多糖，芦荟多糖等Immunity免疫力Antibacterialsubstance

抑菌物质Organicacid有机酸Health动物健康Bacteriophage产生抗菌素挥发性脂肪酸：乙酸、丙酸、丁酸Toleranceoftheintestinalenvironment耐受肠道内环境Bacillussubtilis枯草芽孢杆菌

ZnO

氧化锌

Hypothesis

假设Intestinefunction肠道功能Entericnervoussystem肠神经系统Feedintake采食量Diarrhea腹泻生产性能GrowthperformanceGastrointestinalhormones胃肠激素Mastcellmediators肥大细胞介质IntestinalIGF-1system小肠IGF-1系统

Hormoneoneating采食相关激素ZnOEffectsofdietarysupplementof3000mg/kgZnOontheexpressionoffundicglandGhrelingeneinpiglets

日粮中添加3000mg/kg氧化锌对断奶仔猪胃底腺Ghrelin基因表达的影响P=0.008IncreasetheexpressionoftheGhrelingene

显著提高断奶仔猪胃底腺Ghrelin基因的表达,提高采食量

Improvetheintestinalfunction

药理剂量氧化锌促进仔猪肠道健康Thesmallintestinalmorphologyofweanedpigsreceivingadietwithorwithoutsupplementationof3000mg/kgZn

日粮中添加3000mg/kg氧化锌ZnO对仔猪小肠形态的影响J.Nutr.,X.L.Li,DefaLi,2006ItemsZnSO4ZnOgroupSEMPVillusheight,µm

341387140.036Cryptdepth,µm

19417980.248

IncreasetheexpressionofIGF-1gene

提高小肠IGF-1基因的表达通过IGF-1的旁分泌作用促进仔猪肠道健康和生长Effectsofdietarysupplementof3000mg/kg

ZnOontheexpressionofsmall-intestinalmucosaIGF-1geneinpiglets

日粮中添加3000mg/kg氧化锌对仔猪小肠粘膜IGF-1基因表达的影响P=0.012P=0.041ablibitum

Pair-fedJ.Nutr.,X.L.Li,DefaLi,2006Histamineconcentrationsinthesmallintestineofweanlingpigletsfeddietscontainingnormalandhigh-levelsofZnO

高锌日粮对断奶仔猪小肠组胺浓度的影响Decreasethereleaseofthehistamineinthesmallintestine

高锌显著降低断奶仔猪小肠组胺的释放稳定小肠通透性P=0.005P=0.049P=0.049DuodenumJejunumIleumThenumbersofmastcells(cell/cm2)inthesmallintestineofweanlingpigletsfeddietscontainingnormalorhigh-levelsofzincoxide高锌日粮对断奶仔猪小肠肥大细胞数量的影响Decreasethenumbersofthemastcellsinthesmallintestine

高锌显著降低断奶仔猪小肠各层肥大细胞数改善小肠功能LocationControlTreatmentP

Duodenummucosa74.9±21.936.7±8.9<0.01Jejunummucosa99.7±13.148.8±13.2<0.01Ileummucosa81.4±19.555.1±3.4<0.01

mRNAandproteinlevelsforthestemcellfactor(SCF)geneinthemidjejunumofweanlingpigletsfeddietscontainingnormalandhigh-levelsofZnO高锌对空肠中段干细胞因子表达（基因与蛋白）的影响DecreasetheexpressionofSCF高锌显著降低空肠干细胞因子的表达调控肥大细胞数量及介质释放P=0.016ProteinNormalZnOHighZnOP=0.024mRNANormalZnOHighZnOTheeffectsofdietaryzinconthechangesinIsc(ΔIscZn)

andinG(ΔGZn)

日粮锌对短路电流和电导率改变的影响Comp.Biochem.Physiol.,Z.K.Feng,2006Znimprovestightjunctionpermeability高锌降低断奶仔猪小肠粘膜跨上皮电位差维持肠道紧密连接的完整性ItemsDietsSEMPZn2500DietZnDiet×Zn-Zn+ZnΔIscZn(µm/cm2)9.012.45.10.450.230.84ΔGZn(ms/cm2)1.3a0.4bc0.30.03<0.0010.82Enzymepreparations

酶制剂Complexenzyme-mutationandselection复合酶——诱变选育Aspergillussulphureus-MAFIC001

可高产复合酶的硫色曲霉及其诱变筛育方法和固态发酵制备饲用复合酶的应用Highyieldofcomplexenzyme:xylanase,

-glucanase,pectinase,etc.

高产复合酶：木聚糖酶、

-葡聚糖酶、果胶酶等Industrialproduction

工业化生产，商业利润超过1000万元Aspergillusniger-MAFIC005

饲用非淀粉多糖酶高产菌种的选育及其固态发酵生产技术Highyieldofcomplexenzyme:xylanase,

-glucanase,pectinase,etc.

高产复合酶：木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等Existingquestionsandthemethodstoincreasetheyieldof

-mannanase存在问题及提高

-甘露聚糖酶产量的方法Lowyieldandenzymaticactivity,difficultformassiveapplicationof

-mannanase

产量低，酶活力不高，使

-甘露聚糖酶不能大量推广使用ScreeninghighyieldingA.sulphureusMAFIC001

-mannanase

strainsbyamutanttreatment

诱变选育高产硫色曲霉MAFIC001

-甘露聚糖酶菌种Modifying

-mannanasegenesequenceaccordingtocodonbias

根据密码子偏好性，优化

-甘露聚糖酶基因序列

-mannanase-AspergillussulplhureusMAFIC001

-甘露聚糖酶－硫色曲霉MAFIC001RT-PCRandrapidamplificationofcDNAends(RACE)techniqueRT-PCR和cDNA末端快速扩增技术PartialsequenceC-terminaldomainN-terminaldomain5’-RACE

(5’-fullRACECoreSet)3’-RACE

(3’-fullRACECoreSet)Primer1：5'-TTCAACGACGTCAACAC-3'Primer2：5'-A（T/C）CCAGCC（G/A）TTGCCCCA-3'Primer1andPrimer2usedtoamplifythepartialsequenceof-mannanase

设计引物Primer1和Primer2扩增

-甘露聚糖酶部分序列ObtaintheN-terminalandC-terminalof

-mannanase

genesequenceusingRACEtechnique

使用RACE技术获得

-甘露聚糖酶的N-端和C-端序列1375bp947bp1152bpJBiotechnol.,X.L.Chen,DefaLi,2006Thefirsttimeclonethefull-lengthgenesequenceofA.sulphureusMAFIC001

-mannanase(GenBankaccessionno.DQ328335)首次克隆了硫色曲霉MAFIC001β-甘露聚糖酶全基因序列Modifyingthemature

-mannanasegenesequencebycodonbias

密码子优化改造

-甘露聚糖酶成熟编码基因序列ConstructingP.pastorisexpressionvectorpPICZαA,highdensityfermentationofrecombinant

-mannanasein10Lfermenter

构建毕赤酵母表达载体pPICZαA，实现重组

-甘露聚糖酶在10L发酵罐中高密度发酵Pichiapastorisexpressionvector毕赤酵母表达载体

AFermentationdevice（10L）发酵装置（10升）SDSofexpressed

-mannanaseinfermentorwithdifferentinductiontimes

发酵罐中

-甘露聚糖酶在不同时间的表达量Highestenzymaticactivity(最高酶活力)：1100U/mLPurity

(纯度)：96％Highestproteinexpressionlevel(最高蛋白浓度)：3g/LAccumulationof

-mannanaseactivitywithdifferentinductiontimesforfermentation发酵中

-甘露聚糖酶活性随诱导时间的积累1100U/mLJAM,X.L.Chen,DefaLi,200635kDa45kDa66.2kDa116kDaM12345670h,12h,24h,48h,72h,96h,120h48kDa3.3fold3.9fold

-mannanasecharacterization:anextremelybroadpH(2.2-8.0)range,optimumpHis2.4

酶学特性：pH（2.2-8.0）范围宽，最适pH2.4JAM,X.L.Chen,DefaLi,2006

-mannanase

proteinexpressionlevel

-甘露聚糖酶蛋白表达水平

-mannanaseactivity

-甘露聚糖酶活力Furtherresearch进一步的研究Pilotscale,mass-industrialproduction

中试，实现工业化生产Determinetheefficacybyanimalfeedingtrials

动物试验验证其效果NationalfeedengineeringtechnologyresearchcenterNankoufermentationbase国家饲料工程技术研究中心南口发酵实验基地EnzymeMicrob.Tech.,P.Deng,DefaLi,2006Xylanase木聚糖酶AspergillusnigerMAFIC005Xylanasegene

克隆黑曲霉MAFIC005木聚糖酶xynB基因，GenBank登录号为DQ174549实现了在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达酶学性质表明，与动物胃肠道环境相适应AspergillussulphureusMAFIC001Xylanasegene克隆硫色曲霉MAFIC001木聚糖酶xynA和xynB基因，GenBank登录号分别为DQ355509和DQ168666实现了在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达酶学性质表明，与动物胃肠道环境相适应

+ModifiedxynA改造xynA

pGAPZαA载体ConstitutiveexpressioninPichiapastoris毕赤酵母中的组成型表达Aspergillussulphureus硫色曲霉Thermostabilityofthemodifiedrecombinantxylanase改造的重组木聚糖酶热稳定性研究Enzymaticactivity:120U/mL最高酶活力达120U/mL

Proteinconcentration:3.78mg/mL蛋白浓度为3.78mg/mLGoodstability:

80ºCfor90min热稳定性好，80ºC保持90minHerbalextracts

(Astragaluspolysaccharide,APS)

天然提取物（黄芪多糖）Hypothesis假设InflammationreactionofLPSLPS炎性反应DisorderofGH/IGF-IaxisGH/IGF-I轴异常Immunesuppress(cyclophosphamide)

免疫抑制（环磷酰胺，CY）Immuneenhancement免疫增强Immunetype免疫类型APS黄芪多糖Inflammationfactorsecretion炎性因子分泌-？+--？-？++？-Cellculture细胞培养？(LinearP<0.05)(LinearP<0.05)EffectsofAPSonratioofCD4+/CD8+andLymphocyteproliferationinpiglets

APS对仔猪CD4+/CD8+比值和淋巴细胞增殖的影响Anim.Sci.,S.L.Yuan,X.S.Piao,DefaLi,2006Improvecellimmunefunction,theoptimalAPSlevelwas500mg/kgAPS提高断奶仔猪的细胞免疫功能，增强其对入侵微生物和疾病的抵抗力，促进仔猪健康和生长APS在断奶仔猪日粮中的最适添加量为500mg/kgCD4+/CD8+淋巴细胞增殖EffectsofdietarysupplementofAPSonserumcytokinesinweanedpigsreceivedcyclophosphamide(CY)

APS（注射环磷酰胺,CY）对断奶仔猪血清细胞因子的影响(pg/mL)Anim.Sci.,S.L.Yuan,X.S.Piao,DefaLi,2006－CY＋CY－APS＋APS－APS＋APSd14

IL-255.479.850.677.8IFN-γ133.3160.1111.7138.9ReverseCY-inducedcellimmunesuppressandhumourimmunesuppress环磷酰胺免疫抑制模型研究发现，APS可促进猪的正常细胞免疫，也可逆转CY造成的免疫抑制本研究建立了一种评价APS对仔猪营养和免疫作用的有用模型EffectsofAPSonserumindexinpiglets

APS对仔猪血清指标的影响RecoverthenormalfunctionofGH/IGF-Iaxis炎性细胞因子过度分泌以及GH/IGF-I轴的异常，导致断奶仔猪发生免疫炎症和生长速度下降APS通过降低炎性细胞因子、GH和皮质醇的含量，增加抗炎性因子的合成，恢复GH/IGF-I轴的正常而发挥其免疫抗炎作用

Anim.Sci.,S.L.Yuan,X.S.Piao,DefaLi,2006

－LPS

＋LPS－APS＋APS－APS＋APSd14

Cortisol115.3113.0155.5136.0GH3.823.834.563.94IGF-I235.6240.0215.9224.9bIncreaseNOandiNOSactivityofthe

peripheralbloodlymphocytes

inpigletsAPS显著增加仔猪外周血淋巴细胞NO和iNOS的活性，并呈剂量依赖性EffectsofAPSonNOandiNOSactivityinpiglets

APS对仔猪NO和iNOS的影响J.Anim.Sci.,X.F.Mao,DefaLi,2005*****(P<0.05)*******(P<0.05)EffectsofAPSondifferentcytokines

APS对不同细胞因子的影响

IncreasetheIL-2andIFN-γsecretionT细胞可能是APS直接作用的靶细胞之一APS可在体外促进细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，这可能是APS的免疫调节作用之一Anim.Sci.,S.L.Yuan,X.S.Piao,DefaLi,2006J.Anim.Sci.,X.F.Mao,DefaLi,2005MechanismofimmunefunctionofAPSAPS的免疫作用机理APSiNOSNO细胞因子表达

淋巴细胞增殖+改善动物免疫IL-2etc.IFN-γ++ReceptorGeneknockout

基因敲除Signaltransductionpathway信号传导通路TLRsToll样受体Antimicrobialpeptides

(AMPs)

抗菌肽AMPs

抗菌肽Abundantanddiversegroupsofmoleculesthatareencodedbydefinitegenes

特定编码基因产生的一类小分子多肽Importantcomponentsoftheinnateimmunesystem

先天免疫系统的重要组成成分1:controlwithnoinsert;2-6:positiverecombinantsinduced72h1：对照；2-6：重组菌诱导72h的正对照组（抗菌肽）Processbiochemistry,J.Zhang,2006Antibacterialassay抑菌分析E.coliK12D31AMPs-sensitivestrain抗菌肽敏感菌株Currentsituationandexistingproblems

现状及存在问题ResearchofhigherstructureandantibacterialmechanismofAMPs

研究抗菌肽高级结构和抗菌机理Shorthalf-life,easytoloseactivity

半衰期短，易失活Toxicitytowardprokaryoticcell

抗菌肽对原核细胞的毒性Lowyield,difficulttopurify

天然抗菌肽纯化难度大，产量低ModifythemoleculeofAMPs

优化抗菌肽分子Selectdefinitestrain,andfusionexpression

原核系统中选育特定抗性菌株，真核系统中采用融合