TCIFST 020-2024 食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验PMA-qPCR法

4前 言本文件按照T标准化工作导则 第1部分标准化文件的结构和起草规则的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。本文件起草单位中国食品发酵工业研究院有限公司国家食品安全风险评估中心汤臣倍健股份有限公司山西大学发酵行业生产力促进中心丹尼斯克中国有限公司内蒙古伊利实业集团股份有限公司内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司光明乳业股份有限公司北京科拓恒通生物技术股份有限公司微康益生菌苏州股份有限公司。本文件主要起草人姚粟郭立峥徐进赵溪迮晓雷张国华刘艺茹冯会粉葛媛媛郭茸凯、路春霞马霞王玉琼张旭光毛跃建张锋华马杰方曙光夏九学。食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验R法范围本文件规定了食品中鼠李糖乳酪杆菌的R检验方法。本文件适用于食品原料和固体饮料中鼠李糖乳酪杆菌的活菌定量检验。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。3食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验2分析实验室用水规格和试验方法8实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语定义和缩略语术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光定量Rn在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个进程对未知模板DNA进行定量分析的方法。值e实时荧光定量反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。缩略语下列缩略语适用于本文件。菌落形成单位)脱氧核糖核酸)发光二极管)光密度)聚合酶链式反应)叠氮溴化丙锭m)实时荧光定量)一种荧光染料)14原理是一种能与结合的光反应染料可透过受损细胞膜与菌体发生共价交联从而抑制受损菌体A的R扩增。样品经A染料处理A提取后采用鼠李糖乳酪杆菌特异性引物进行R扩增。细胞膜结构完整的活菌菌体A在R扩增反应中能够产生荧光信号。当扩增产物的荧光信号达到设定阈值时可被实时检测并生成值将t值代入标准曲线方程中计算获得样品中鼠李糖乳酪杆菌的活菌数量。仪器设备实时荧光定量仪。高速台式冷冻离心机。酶标仪。4恒温培养箱6℃1℃。5生物安全柜或超净工作台。6冰箱2℃5℃0℃~0℃。涡旋振荡仪。D光解仪最大功率0W频率00D输出波长。珠式样品研磨器速度88。拍打式均质器。高压灭菌锅。天平精度。微量可调移液器及配套吸头。试剂或材料除特别说明外仅使用分析纯或生化试剂实验用水应符合2中一级水。无菌均质袋。无菌离心管5。无菌玻璃珠粒径1。无菌研磨管2。荧光定量8连排管或6孔板。6孔细胞培养板。n琼脂培养基见3附录A中。A溶液浓度0。无菌超纯水或无菌双蒸水。05无菌生理盐水见3附录A中。实时荧光定量混合试剂。X参比染料×。阳性对照鼠李糖乳酪杆菌T=T菌株A或扩增片段的阳性克隆分。24检测步骤样品制备及前处理按照3中1规定的方法将待检测样品制备成0的样品匀液。采用微量移液器以无菌操作吸取1制备的0样品匀液L注入6孔细胞培养板中利用酶标仪测定样品0值。将0样品匀液稀释至0值为5时总菌体数量约为8。吸取8L样品匀液注于5L无菌离心管中。样品处理在避光条件下以无菌操作吸取A溶液注于3的离心管中颠倒混匀至少0次制成A终浓度为L的样品溶液。将样品溶液置于暗处室温孵育5每隔1n颠倒混匀一次。将样品溶液置于D光解仪内曝光照射5曝光结束后于室温下n离心5n弃上清液。提取吸取无菌超纯水注于3的离心管中反复吹吸使之混匀。吸取1中的全部菌液注于装有g无菌玻璃珠的2L无菌研磨管中。将无菌研磨管置于珠式样品研磨器中以6s破碎速度破碎。于室温下n离心5获得A粗提液。取L上清液注于5L无菌离心管中贮存备用。或采用具有相同效果的基因组提取方法进行提取。实时荧光定量扩增实时荧光定量反应体系实时荧光定量R反应体系总体积为5其中含实时荧光定量R混合试剂×5L上下游引物各X参比染料A模板无菌超纯水。每个反应体系应设置至少3个平行反应。实时荧光定量R检测特异性引物序列分别为上游引物-下游引物-目标基因产物约为。注反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同的反应总体积作适当调整。实时荧光定量反应程序实时荧光定量R反应程序为555收集荧光信号2,进行0个循环。注反应程序根据不同型号实时荧光仪和所选扩增体系不同作适当调整。实验对照实验设立以下对照。阳性对照鼠李糖乳酪杆菌CT=CT菌株A或扩增片段的阳性克隆分子。 : 。阴性对照非鼠李糖乳酪杆菌DNA空白对照无菌超纯水。34标准曲线通用要求。制备标准曲线时需设置至少5个浓度点。制备标准曲线时需设置至少5个浓度点且设置的最低浓度点宜尽量接近该扩增目标的定量下标准曲线的制备将鼠李糖乳酪杆菌TT或从待测样品中分离出的目标鼠李糖乳酪杆菌接种于S琼脂培养基中于6℃1℃培养获得纯培养物。用无菌接种环挑取适量菌体于无菌生理盐水中充分振荡混匀。参考用无菌生理盐水将2中菌液稀释至菌体浓度为8。根据B3中乳杆菌的培养方法检测活菌总数。按2处理3制备的样品按3提取样品基因组并对A溶液进行0倍梯度稀释。利用建立的R反应体系和扩增程序测定每个稀释度A对应的值根据样品活菌总数对数值和扩增值的线性关系绘制标准曲线。标准曲线即以活菌总数的对数值为横坐标以值为纵坐标作图获得标准曲线方程。结果分析与计算质量控制下述指标有一项不符合者需重新进行实时荧光定量扩增。空白对照值;阴性对照值;阳性对照值。被检测样品值应在标准曲线测定范围内进行适当调整后重新进行检测。结果计算

如不在标准曲线测定范围内

则需对样品浓度当样品值在标准曲线的线性范围内按式计算。nBn0Ann

………()式中:

N= 1 d 1N