分子生物学 第3章学习资料

第3章

DNA复制

(DNAReplication)3.1.基本概念3.2.复制起点与方向

3.3.Semi-ConservationReplication

3.4.复制的方式

3.5.线状DNA的复制3.6.DNA复制的基因与酶类体系

3.9.MethylationofDNA3.7.DNA复制的调控3.8.核小体的复制

3.1.基本概念

(BasicConcept)遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的突变控制性状的表达DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,

合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●

Replicon

复制子;●Replisome

复制体;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli

37℃0.5h105bp/min

S6-8hs

M1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105

bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)

3.2.复制起点与方向（replicationorigin&direction）

isolationoforiC复制起点的特征J.W.Zyskind

克隆到E.coli

oriC确定其最小区段为245bp，并与沙门氏菌等4钟细菌的oriC序列进行比较分析发现；

245bpminimaloriginofreplicationrichAT&DNApolymerase(DnaA)bindingsiteoriCRNApol

发动primer真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的ATrich

“呼吸现象”

DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。

在富含AT的区域内尤为明显

replicationorigin

两侧基因的转导频率高

4a4b3c3d2e2f1g1haobcaobdecaobdfgecaobdfh

复制的不同步性断裂的随机性replicationoriginMostrDNAarelocatedneartheoriginofreplication复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向1963Cairns

37℃,5

ci/mM

H3-T,6min37℃,52

ci/mM

H3-T,6min42℃,

T,onecircle复制多模式的证据模式？E.coli

thy-slow-stopmut.ts

复制发动温度敏感突变型42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸慢停突变(slow-stopmutation）当温度升高，复制停止在下一周期开始快停突变(fast-stopmutation）当温度升高，复制立即停止？模式？单起点、双

方向两个复制叉R.L.RodriguezE.colithy-slow-stopmut.

ts42℃37℃,

5

ci/mM

H3-T,20min37℃,52

ci/mM

H3-T,20min复制模式分别是什么样的?子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonlyOHTCATCA

COH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

进化中保留的最经济、最有效的方法5’PPP5’PPP如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHG

ATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl

的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

A

TCG

pppOH+

pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH

3.3.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）

Threereplicationhypotheses(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘a)Okazakifragment1968ReijiOkazakiE.coli[t-]2’’,7’’,15’’,60’’pulse-labelingindT-H3

stopinKCN0℃D.S.DNAS.S.DNADensitygradientofsucroseMeasureH3-T

pulse-chase20℃indT-H3

120’’transfertodTthencontinueH3-Tpulse-chase

pulse-labeling120’’60’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S

(Prok.400Nt/sec)DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

？半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

证据

dumpfragmentinDNAdUTP

:dTTP=1：300incell

---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase

少数dUTP

DNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200

！？---A---

---A---

---U------

---Ungase

ungU尿嘧啶-N-糖基酶UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●

ung

–

dumpfragmentlonger●dut

–

dumpfragmentshorterAApulse-labelingindT-H3？leadingstrand(indUMPF.)laggingstrand（inO.F.）Lig

(ts)？直接证据？DNAsemi-discontinuousreplication

leadingstrand,laggingstrand

均有dUMP

的掺入

Okazaki片段在某种意义上为

dUMP

片段先导链按dUMP

片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复制(Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb)3.4.DNA复制的方式

(DNAreplicationmodel)

primer

DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始

!E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliE.coli[RifR]M13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifampinM13Rifampin有M13RF有M13RF

M13Rifampin

Rifampin

是E.coliRNApolymerase

的抑制剂

M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物

RF启动后，RNA引物已经形成,Rifampin

的抑制无效ConclusionThefirstevidencesupportingRNApriming●新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）

startingpoint

(Cairnsmodel,θform,thedaform)→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand

→

fork→laggingstrandmultiplereplicon

Eukaryote(500-5000bp/min)

DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成对后随链引物的合成完成10±NtRNA引物合成后.

DNApolIII进行DNA链的延伸

DNApolI对RNA引物切除并聚合填补连接酶(ligase）将Okazaki片段，

dUMP

片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion●共价延伸方式（covalenceelongation）

或滚环方式

（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→

LaggingStrand(δform,deltaform)5‘3’3’3‘共价延伸方式transcriptionalactivation?●置换式（Displacementform）

D.S.DNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop复制叉两侧DNA双螺旋的解旋E.coli

C/genome=4.2X106bp

30-40’/每次复制历时

10bp/每圈螺旋

84000-105bp/min解旋

(8400-10000rpm!高速离心机)能量？复制叉两侧DNA双螺旋的解旋DNAtopoisomeraseIDNA的单链瞬间断裂（transientsingle-strandbreak）缓解高速旋转，引入正向超螺旋，解出overwinding的应力DNAtopoisomeraseIIDNA的双链瞬间断裂（transientdouble-strandbreak）

缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕引入负超消除复制叉移动时产生的正超DNAHelicase(DNA解旋酶）

ATpase活性，解除1氢键／水解2ATPTopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)DnaBproteinDnaCproteinPrimase（dnaG）Ung-ase

DNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligase

forprimosome复制体进化中形成了灵活的多酶复合体replisome进化中形成了灵活的多酶复合体replisome

位于复制叉处的多酶复合体完成

laggingStrandDNA延伸时必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段

InlaggingStrand多酶系统必须完成多次反复的启动与扩展

E.coli

启动2000—4000次的冈崎片段复制Replisomemodel(后随链的回环模式)ReplisomeincovalenceelongationSSB3.5.线状DNA的复制及避免5’末端短缩的模式

（5’-endshorten）

3’-OH?

3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?

WatsonJ.DT7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

(100dNtterminalredundancy)??concatermer

3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHb)ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA

35937bp

pTP

C

G

IR103-162

IR;including50bpreplicationorigin

richAT&1thC/Ghighconversation

pTP;pre-Terminalprotein80kd

→

TP55kdSSB;S.S.DNAbindingprotein72kd

Ad2DNApolymerase;

140kd

复制起始复合体引发复制（不需引物）

避免5’-endshortenpTp-Ser-dCMP

CG●过程

SSB+ATPDNA末端解链

TP

pTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OHIRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNA

HairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TPc)真核生物染色体DNA末端补齐模式

●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破pBR322PvuBg1ARSTELTELBamH1BamH1四膜虫rDNABg1PvuBamH1转化酵母Pvu传代酵母TEL？！

ShampayJ.&Blackburn加尾实验转化酵母

传代酵母TELPvu

酶切连接Pvu酵母DNAPvu酵母TEL酵母TEL？！端粒的模板链在何处?端粒酶的发现为揭示端粒序列复制的模板及避免5’端短缩的机制奠定了重要的基础

端粒的模板链在何处?加尾实验未能证明延伸端粒序列的模板从何而来？

●端粒DNA(Telomere)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.CarolGreider&Blackburn,

1986.Gottchling

尖毛虫telomerebindingprotein–155kdtelomerebindingprotein–226kd四膜虫telomerase游扑虫

telomerase+100bptelomere

200－500KDaRNACAAAACCCC链+具有逆转录酶活性的

末端结合蛋白(TBP）

1990Yu和Blackburn在体外加尾实验的反应体系中

加入这段RNA区域的反义序列GTTTTGGGGTTG证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板端粒酶的加尾功能受到明显抑制1990Yu和Blackburn在体外加尾实验的反应体系中证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板转化四膜虫后代的染色体端粒出现了突变序列的端粒对CAACCCCAA序列进行诱变

model

TBPisReversetranscriptase-like

RNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNA

ElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’TTGG链

–T2G4-----GGTTGGG

C链--A2C4----TTG

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’GGGTTGG链

–T2G4-----GGTTGGG

C链--A2C4----TTGGGGTTG-------------

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’

GGhoogsteenbond

Tetraplexhelix

G链–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC链--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorTelomeraseactivity

isrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.Asthisshorteningreaches

informationalDNA,

thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值informationalDNA细胞停止分裂或死亡Whentelomeraseactivity

isrepressed人体发育完成，端粒酶被抑制，细胞分裂次数与端粒长短呈反比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度长短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命

XXXYwhy?生殖细胞、癌细胞的繁殖(端粒酶的激活！细胞得以永生！)随着组织、细胞的老化染色体端粒的长度变短小麦不同细胞内端粒长度的变化TheterminationofDNAreplicationE.coli

(单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）

terE,D,AterF,C,B(22bp保守区)FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS复合体

terE,D,A仅对反时针方向的复制叉具有终止效应

terF,B,C仅对顺时针方向的复制叉具有终止效应FBCADETer-TUS复合体

(Rep.forktrap)防止DNA过度复制避免出现DNA多聚体，高拷贝3.5

DNA的复制基因与酶类体系

a)原核生物的复制基因与酶类

Initiategenes

dnaB

prepriming300kd~20copies/cell

hexamerRNApol

primaseforleadingS.dnaCactswithdnaB25kddnaG

primaseforlaggingS.60kd~25(Okazakifragment)monomer

SSB

BindingwithS.S.DNA74kd~300PreventsfromannealmonomerElongategenesdnaE

DNApolymeraseIII(α)140kd~20dnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kd~20polA

DNApolymeraseI109kd~400polB

DNApolymeraseII90-120kd~100Topoisomerase

rep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNA

ATPase1H-bond/2ATPlig

Ligase

HDP

HelixDe-stabilizingProteinNoATPaseactivityBindingS.S.DNAdecreaseTmPreventsfromanneal切口酶活化(T4)(E.coli)切口腺苷化封口连接dAMPb)DNA聚合酶（DNApolymerase）

PolA

polB

dnaE

dnaZ

109kd120kd>250kd

monomerProkaryote

IIIIII

5’→3’聚合酶活性

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+ppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

hetero-multimer

主要用于DNA的修复DNA链延长的主要聚合

RNA引物的替换

3’→5’外切核酸酶活性(编辑功能)mismatch10-810-3yes

5’→3’外切核酸酶活性

去除已配对的带有No

去除未配对的带有

5’磷酸的NTP或dNTP5’磷酸的dNTP

可以产生切刻平移作用

(nicktranslation)

无切刻平移作用

(去除了该活性的DNApolymeraseI叫klenowfragment,PCR反应中用的聚合酶)IIIIII

mutationlethalmutationlethal

核酸内切酶活性DNA带有5’磷酸不配对单链时,polⅠ可以在与此单链相连的两个配对碱基之间切断磷酸二酯键NoNob;primersite

c;primerterminater

a;templatesited;

dNTPsite

e;

3’→5’repairsite

36kde胰酶75kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNApolymeraseIDNApolymeraseIII(原核生物DNA复制中链延伸的主要酶)activableDNApolIII

DNApolIII(holoEnzyme)

α+α(dnaE)→DNApolIII(pureEnzyme)+EF-II

730nt/sec.

invitro1000nt/sec.Invivoβ+β(dnaZco-polIII)+c)真核生物DNA复制的特点及聚合酶●

multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.500-5000bp/min13-900kb/perreplicon

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蝇5000replicons受精后genomereplication/3min

●

每个复制子在一个细胞周期中只启动一次，启动时间上并不一致

复制元:也叫复制子,从复制起点到终点的一段DNA序列.几个邻近的复制元组成复制元族.

不同的复制元族在复制起始的时间上有先有后,而同一复制元族的各个复制元基本上是同步的.Replicons

扩增到50,000（机制尚不清楚）●DNApolymerase

α(主要酶类)βγ

Maxi.polMini.polNucleiNucleimt120-300kd30-50kd150-300kdpolymerize5’→3’yesyesNoediting3’→5’NoNoDNA复制的主要酶损伤DNA的修复线粒体DNA复制与引发酶紧密结合

与真核细胞多起点复制特点相对应的是真核细胞中DNA聚合酶的分子数量也很多.在一个大肠杆菌中细胞中只有10-20个pol

III,而一个典型的动物细胞含有DNA聚合酶α2000-60000个分子.DNApol-δhaveeditingactivity3’→5’3.6.真核生物复制过程中的核小体结构

核小体是真核生物染色质的基本结构单位,每个核小体包括200bp左右的DNA和一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1。

组蛋白八聚体核心颗粒是由H2A、H2B、H3和H4各两个分子组成,这四种组蛋白称为核心组蛋白。位于组蛋白八聚体核心颗粒表面上的DAN称为核心DNA(166bp),位于两个核心颗粒之间的DNA则称为连接DNA,组蛋白H1就在连接DNA上。真核生物染色质复制过程中,DNA是半保留复制,而DNA所缠绕的组蛋白八聚体却是全保留的。组蛋白的合成是在细胞核中与DNA的复制同步进行的,细胞中没有明显多余的组蛋白分子。DAN复制过程中旧的组蛋白八聚体是否解离,又如何与新的组蛋白重组?++亲本八聚体新合成的组蛋白全保留装配随机装配或或其它半保留装配

将细胞置于轻培养基(12C,14N,1H)中生长一段时间,然后将细胞转移到重培养基上(14C,15N,3H)生长1小时,分离组蛋白八聚体,在甲酸饱和的密度梯度中进行平衡离心。得到了一个高密度的放射性带,证明了是全保留形式这些旧的八聚体蛋白在两条子代DNA链上是如何分布排列的呢?偏袒分布相间分布随机分布用上述密度梯度平衡离心的办法分析交联的相邻八聚体,证明是偏袒分布用蛋白质合成的抑制剂放线菌酮可以得到同样的结论。将放线菌酮加入到正在生长的细胞中,在此之前开始的复制将继续下去,由于组蛋白在细胞内是现用现造的,在加入蛋白质抑制剂后,就没有新的组蛋白合成核小体八聚体了。在电子显微镜下看到两个复制叉的两边,有一个分支的DNA是裸露的。这一结果表明,组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链。病毒SV40,它的亲本八聚体是先导链的摸板链结合。3.7.DNA复制的调控

从复制原点起始一轮DNA复制,特异性蛋白质因子对原点的识别和结合是关键的一步。当DNA复制起始后,这种可为复制机构所利用的状态发生改变,或者是DNA被修饰(如甲基化和去甲基化等),或者是蛋白质因子被修饰(磷酸化或去磷酸化等)。这样,使得在一个细胞周期中复制原点只能被使用一次。拷贝数的控制:

每个细胞中只有1-2个拷贝的质粒成为严谨型质粒(stringentplasmids)或低拷贝数质粒。每个细胞中只有10-100个拷贝的质粒成为松弛型质粒(relaxedplasmids)或高拷贝数质粒。

质粒是细菌中独立于细菌染色体之外的可以进行复制和遗传的辅助性遗传单位,但是它们的复制和转录又依赖于宿主编码的一些酶和蛋白质。细菌质粒是一些双链环状DNA分子,大小从1kb至200kb以上。质粒DNA的复制要由负责细菌染色体复制的酶群来完成,但是每种质粒含有控制其拷贝数的基因。Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2Positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOH

RNA-2DNA

/RNA

primerforDNAreplication

e.g.ColEIplasmid(15-20)NegativecontrolRNA-1110bp

RNaseH不能识别D.S.RNA-1/RNA-2,

不能通过转录激活形成primer

的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNARNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促进

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2

只能转录100-220base,

不能到达“0”原点

不能形成primer

的3’-OH0

ColEIplasmid(15-20copies)以负控制为主的调控方式防止过度复制不相容性质粒具有共同的复制调控机制(相同的或相似的阻遏物)

(相互竞争,相互制约)相容性质粒(F,ColEI)复制调控机制完全不同

(和平共处,互不干扰)质粒的自私特性即不相容特性(incompatibility)与复制起始的控制相关3.8.DNA的甲基化（Methylation）

(m5CinEukaryote)

m5C

a)DNA中m5C的特点

●对MspI,HpaII

位点的高频修饰

MspI

HpaII

CmCGG