高考生物二轮复习讲义：基因工程

基因工程

知识构建

1.限制酶的选择技巧

（1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SwI。

②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PsfI和

EcoRI两种限制酶（但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙）。

PstISmaIPstI

*I,IPstI

标记基因「EcoRI

SmaI目的基因EcoRI

Sma1V"""""

甲乙

⑵根据质粒的特点选择限制酶（如图）

其切点不

在启动子

.Xho1

与终止子一其会破坏启动

"加dill一子，不宜选择

之间，不.《素启”

宜选择，谭点口其切点位于启动

管因终耳

pamHIJ子、终止子之间,

、EcoRI宜选择

其切点位\其会破坏终止

于标记基

因上，不宜KpnI子，不宜选择

选择1

其会破坏复制原点，复制原点被破坏后，目

的基因不能在受体细胞中复制，不宜选择

⑶根据Ti质粒的T—DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取（假设切割目的

基因的限制酶为XbaI和SacI）。

T-DNAT-DNAXba]SacIXbalXba\

\jGT-DNA\jGT-DNA

演i忘心回位b

时乙/丙

---------X、T\

:切割位点位于T-DNA

切割位点切割位点虽在T-DNA

，上，而且含X6aI、Sac【

不位于:上，但仅一种限制酶,

［两种限制酶切割位点,;

T-DNA切割后容易造成自身

且与目的基因两端切：

上环化

，割位点相同

2.基因表达载体的构建过程（如图）

质粒

外源DNA

同一种限制酶或产生相

同末端的限制酶切割

两个切口，获得

一个切口•DNA连接酶一^

目的基因

两个黏性末端

基因表达载体

3.Cre/LoxP重组酶系统

（l）Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP

位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。

（2）LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组

酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。

abc

5-iATAACTTCGTATAI-GCATACAT-ITATACGAAGTTAT;-3,

B'-iTATTGAAGCATATl-iCGTATGl^A：-ATATGCTTCAATA卜5'

图1LoxP序列的结构示意图

⑶①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序

列，仅保留一个LoxP。

②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。

图2Cre/LoxP重组酶系统的作用机理示意图

4.CRISPR/Cas9基因编辑

CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间

隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体

的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录

的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体（形成平末端）释放到细菌体内的DNA,从而阻止噬菌体在细菌体内繁

殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：（1）内切酶（Cas9酶）切割噬菌体获取新的间隔序列；（2）将其引入原间隔序列并

转录出crRNA；（3）crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。

PAM(5'-NGG-3')

,靶DNA

IIIIIIlLs)TTTTTTr^

crRNA<^R^-tracrRNA

3'5,连破环

双链DNA特异位点断裂

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII111111

5.In—Fusion技术

In-Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或

多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15〜25个同源碱基，而目的基因两端的同

源序列往往是通过引物设计实现的，In—Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端,

DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。

⑴质粒构建过程:①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化;②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增;

③反应体系内形成重组质粒。

(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳

性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。

真题演练

1.（2024•全国甲，38节选）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,

与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在

_______________________________________________________________（答出两点即可）；

使用酶C单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是o

I**

AGATCTAAGCTTGATATC

TCTAGATTCGAACTATAG

fff

酶a酶b酶c

2.（2023•全国乙，38节选）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GPP基因为材料，利用基因

工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建

表达载体，其模式图如图所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为;②为,其作用是

图中氨节青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是

复制原点

氨茉青霉素②

抗性基因

表达载体

GFP突变基因

①

3.（2022・福建，13节选）载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用X/?。I和SRI分别酶

切CD/4和图中载体连接，CD/4接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶

对CD14的连接方向进行鉴定，理由是

抗性基因

4.(2024•新课标,35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(Bi)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。

该小组在含有N基因的质粒中插入Bi基因组的Ml与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端

分别为Ml与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入Bi的基因组，得到菌株B?。酶切位点(I〜IV)、

引物(P1〜P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，一表示引物5'-3'方向。回答下列问题：

启动子p]

N基因

终细菌B1基因组

质粒P2J止L片段甲替换区T

子：：

P—3»i।

IlII

InMl河M2

标记基因

(1)限制酶切割的化学键是。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将Ml与M2片段分别

插入质粒的I和II、III和IV酶切位点之间，原因是

(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌Bi基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B,基因组DNA互补配对可以

形成的碱基对有G-C和.

5.(2024.湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从

野生百合中获得一个抵抗尖抱镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是

一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。

g复制原

”抗性基因\\

SmaI

Ti质粒)

启动子PL勿塞因哆氮同

\启动壬//

Sac

MHISmaI1叫给HI

HindUI

SacISmaIj

图a图b

□对照口尖抱镰刀菌

5□交链格也

蜩

一

以

“

、S3

・

里T

U60

I5(

U

fsfiI40

n・

DL30I

20

一

・10/

o

l

u

d

)I

PlP2P3

图c

(1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL,首先选用.酶切，将其与相同限

制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(Pl、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图

Co由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中的诱导作用最强。

(2)现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,

培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：

6.（2023•海南，20节选）我国开发了一种新型基因递送系统（切一浸一生芽，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常

规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则：

⑴图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是

图1图2

⑵已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除尸。5基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光

蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛

状根中获得阳性毛状根段的方法是,图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发

挥作用的方法是,依据是

模拟练

1.研究人员将靛蓝色素酶基因（/DG）与启动子PTL12（棉纤维细胞特异启动子）相连以构建基因表达载体（如图，Kpnl、

Hi〃dni、BamHI、PsfI代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点），并最终培育出能在棉纤维细胞

中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是

Kpn\

T-DNA】Hind]S[

0G电督粒A；①

质粒

Ps4/JKpn\+Hind]RTiHIDG

P1L12

HindJU-BamHI

BamHI③

质粒B》PTL12_®.

重组Ti质粒

BamHI+KpnI

'KpnI

过程①②都使用KpnI切割质粒，目的是

2.（2024•天津宁河区高三一模）蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2,从而提高细胞光合速率。我国科学家构建

了叶片特异性启动子Cab（叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子）驱动的蓝细菌ictB基因表达载体,并通过农杆菌转化法

获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组

DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：

SpeI

MBatnWIIN

基因Cab启动子

重组DNA分子

Sa”3AI限制酶识别序列及

EcoRVSpel切割位点：

潮霉素终止子BamHI:G^3ATCC

抗性基因

T-DNA

SpeI:ACTAGT

*

Ti质粒EcoRV:GATATC

卡那霉素

抗性基因Sa“3AI:GATC

BglI:AGATCT

图1

（1）为使重组DNA分子能定向插入T-DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可

知，M端添加的序列所对应的限制酶是,N端添加的序列所对应的限制酶是。添加了限制酶识别序

列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要种酶。

（2）将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入进行筛选，最终获得多个水稻

株系ai、a?、a3、阳。对ai〜山四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2,其中明株系ictB蛋白表达量较

低的原因可能是__________________________________________________________________________________

检测应选用的植物器官是，原因是_______________________________________________

图2

3.随着土壤盐渍化(主要是Na+引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K+

可维持细胞内K+/Na+稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K+转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。

为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP—8和KFP一”融合基因的表达载体。CFP和KFP分别是青色荧

光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP—8的表达载体，选择了已经包含的载体pl300—CFP。相关

信息如图所示。请回答下列问题：

ATGGCCGGC.....................TCTGAGTAG

CFP基因序列：

ATGGTGAGC.......................CTGTACAAG

BsrG]

多酶切位点：

JGTACAGGGATCCATCTGCAG

2518BsrGIBamH1Pst[

注：图中序列仅显示转录的非模板链；按5，-3，

方向书写；“…”代表的碱基是3的倍数。

(1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是

________________,理由是___________________________________________

(2)据此，研究人员使用的两条引物序歹U分另(J为5'-XXXXXXNNATGGCCGGC-3z和5'-YYYYYYCTACTCAGA

—3'。X和Y分别代表⑴选择的酶切位点，N代表任意碱基的核昔酸。第一条引物中NN的作用是

第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是

用同样的方法获得了含"了一”融合基因的表达载体。

4.通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr—sacB双重选择系统可对基因

进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其

中止产是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X—gal水解成蓝色化合物。

回答下列问题：

a.................b

‘礁底显囱'

I同源重组

aIb

.a’靶基因b’.

I

ab

重组DNA

图1体内同源重组原理图

sacB基因

\①PCR基因

BamHEcoR质粒3

HindJR

质粒2

复制原点

，加dill

XtnaI

④提取大肠杆菌甲

③导人

质粒3

同源⑤PCR同源序列

序列\:

tef-sacBtef-sacB

⑥导人I口cZ基因

大肠杆菌乙

⑦I

筛选〃cZ基因敲除菌株同源重组机理

@

LacZ基因回补

图2

限制酶EcoRIBamHIHindIIIXmaI

识别序列和

切割位点5’—GA5’—GG5’—AA5'—CC

ATTC—3，ATCC—3，GCTT—3'CGGG—3'

⑴据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是

(2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加、限制酶的识别序列；过程⑤中，设计

两种引物时需在引物5,端分别添加_______基因两端的同源序列。

(3)图2过程⑦中，在含有的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同

源重组技术结合tet「一sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加

5.PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可

引发腓骨肌萎缩症(CMT1A),科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题：

图1CRISPR/Cas9系统原理

PMP22PMP22

基因基因

异常细胞

染色体

DNAI

ngRNAgRNA

"结合位点结合位点

CRISPR/Cas9

处理

胞内

基因修复

图2基因编辑方案

gRNA对应DNA

(30()bp)

限制酶识别序列与切割位点:

AcoRl：5'-GAATTC-3,

Sall：5,-GTCGAC-3,

BamHl:5'-&ATCC-3'

X/wI：5'-C*CGAG-3'

图3基因表达载体

(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过

程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是

(2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比

起原方案的优点是____________________________________

(3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。

①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时,需要在上游和下游引物的5,端分别添加碱基序列

和，保证DNA片段定向插入。

②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是o

6.(2024青岛高三二模)某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育

系的思路是将育性恢复基因OsNP/(在原始生殖细胞中表达)、花粉失活基因ZM—A4(在花粉中表达)两个基因一起构建

重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合但两个转基因

位点是杂合的可育植株。

⑴图1为已导入ZM-AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNPl基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使

OsNPl基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有；采用

PCR技术扩增图2中的OsNPJ基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNPZ基因在第〃次循环中新合成

的短链数为o

注：新霉素抑制真核细胞生长，卡那霉素抑制细菌生长。

图1

EcoRIOsNP/基因EcoR1

A链HO--------

B链©—厂—

HindJHSmaIBamHI

图2

⑵重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是

⑶若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与

,重组在一起。

答案精析

真题演练

1.避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化T4DNA连接酶

2.终止子启动子RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA鉴别受体细胞中是否含有目的基因，

从而将含有目的基因的细胞筛选出来

3.正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两

种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）

4.（1）磷酸二酯键不破坏N基因，使Ml与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达（2）C—G、

A—T、U-A

5.（l）ffindllLBamHI交链格抱（2）利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动

子pL

解析⑴根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶”讥dill、

BamWI进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可

知，交链格胞处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。（2）欲培育具有高抗病原微生

物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pLo

6.（1）农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T—DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA

整合到一起（2）荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根观察幼苗是否表现出白化特征PDS缺失会导致植株白