系统生物 第二章 先进测量平台学习资料

第二章先进测量平台色谱法：当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测；两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。色谱法分类:1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。利用电泳现象对化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson等用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术：高效毛细管电泳。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一、采用了<0.1mm内径的毛细管二、采用了高达数万伏的电压毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万/米，特殊柱子可以达到数百万。电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流>ν电泳时，阴离子在负极最后流出，在这种情况下，不但可以按类分离，除中性粒子外，同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，获诺贝尔化学奖；生物芯片--微量点样原理将预先制备好的核酸、多肽或蛋白质灯生物大分子用特殊的自动化微量点样装置(精密机械手)以中等密度互不干扰地点印于经过特殊处理的基片上，并使之与支持物牢固结合。微量点样法一般分接触法和喷墨法(非接触法)两种。2-19质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比（m/z）的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。1912年：Thomson研制了世界上第一台质谱仪;1922年：Aston固用质谱法发现同位素并将质谱法应用于质量分析而获得诺贝尔奖；2002年：Fenn和Tanaka发明了生物大分子的质谱分析法而获得诺贝尔奖。单聚焦质谱仪双聚焦质谱仪四极杆质谱仪飞行时间质谱仪离子阱质谱仪傅立叶变换质谱仪串联质谱仪2-97Theligase-mediatedsequencingapproachoftheAppliedBiosystemsSOLiDsequencer.InamannersimilartoRoche/454emulsionPCRamplification,DNAfragmentsforSOLiDsequencingareamplifiedonthesurfacesof1-μmmagneticbeadstoprovidesufficientsignalduringthesequencingreactions,andarethendepositedontoaflowcellslide.Ligase-mediatedsequencingbeginsbyannealingaprimertothesharedadaptersequencesoneachamplifiedfragment,andthenDNAligaseisprovidedalongwithspecificfluorescentlabeled8mers,whose4thand5thbasesareencodedbytheattachedfluorescentgroup.Eachligationstepisfollowedbyfluorescencedetection,afterwhicharegenerationstepremovesbasesfromtheligated8mer(includingthefluorescentgroup)andconcomitantlypreparestheextendedprimerforanotherroundofligation.2-98Principlesoftwo-baseencoding.Becauseeachfluorescentgrouponaligated8meridentifiesatwo-basecombination,theresultingsequencereadscanbescreenedforbase-callingerrorsversustruepolymorphismsversussinglebasedeletionsbyaligningtheindividualreadstoaknownhigh-qualityreferencesequence.2-122Approachestonanoporesequencing.(a)Strand-sequencingusingioniccurrentblockage.Atypicaltraceoftheioniccurrentamplitude(left)throughanα-hemolysinporeclearlydifferentiatesbetweenanopenpore(topright)andoneblockedbyastrandofDNA(bottomright)butcannotdistinguishbetweenthe~12nucleotidesthatsimultaneouslyblockthenarrowtransmembranechanneldomain(redbracket).(b)Exonuclease-sequencingbymodulationoftheioniccurrent.Anexonuclease(paleblue)attachedtothetopofanα-hemolysinporethroughageneticallyencoded(deepblue),orchemical,linkersequentiallycleavesdNMPs(gold)offtheendofaDNAstrand(inthiscase,onestrandofadouble-strandedDNA).AdNMP’sidentity(A,T,GorC)isdeterminedbythelevelofthecurrentblockadeitcauseswhendrivenintoanaminocyclodextrinadaptor(red)lodgedwithinthepore.Afterafewmilliseconds,thedNMPisreleasedandexitsontheoppositesideofthebilayer.(c)NanoporesequencingusingsyntheticDNAandopticalreadout.EachnucleotideinthetargetDNAthatistobesequencedisfirstconvertedintoalongerDNAstrandcomposedofpairsoftwodifferentcode-units(coloredorangeandblueforillustration);eachcode-unitisa12-base-longoligomer.AfterhybridizingtheconvertedDNAwithmolecularbeaconsthatarecomplementarytothecodeunits,thesebeaconsarestrippedoffusingananopore.ThesequenceoftheoriginalDNAisreadbydetectingthediscreteshort-livedphoton-burstsaseacholigoisstripped.(d)Strand-sequencingusingtransverseelectroncurrents.DNAisdriventhroughananoporefunctionalizedwithembeddedemitterandcollectortunnelingprobes(orange)andabackgate(black).TheamplitudeofthetunnelingcurrentsthattraversethroughthenucleotidesisexpectedtodifferentiateeachnucleobaseastheDNAiselectrophoreticallydriventhroughthepore(arrow).2-125SNP同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，大约平均1000个碱基对就会出现一个SNP，估计整个人类基因组30亿碱基中至少有300万个SNP。

SNP大都表现为二等位基因多态性，即在该位置只存在两种不同的碱基。

SNP作为一种碱基的替换，大多数为转换(C-T，G-A)，也可能是颠换。在CG序列上出现最为频繁，多发生C-T转换，原因是CG中C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。

SNP在基因组中可被人为的划分为两种形式：一是分布在基因编码区的功能性突变，称为cSNP；二是处于非编码区的大量单碱基变异。从对生物的遗传性状的影响来看，cSNP又可分为两种：同义cSNP、非同义cSNP。2-126以荧光共振能量传递(FRET)为基础的检测方法。在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基，会减少探针与目标序列结合的紧密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区分。2-127分子信标是一个U型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一定程度的互补配对)，在探针两端也加上供者-受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮，使碱基突变链和正常链得以区分。2-186Currently,therearetwomainapproachesforSCP.Oneisflowcytometry.Scientistcollectprimarycellsfromhumantissue,thenmaketheproteinslabeling.Allthecellsonbyonepassthruthedetectionwindowofflowcytometry.Fromthedata,scientistcanmapoutthepotentialsignaltransductionpathwayandnetwork.Itisbiologist’sapproach.2-187Almostatthesametime,Dovichiproposedanotherapproach,calledchemicalcytometry.Theydevelopedaverysmart2DCEsystemsandgaveafingerprintofasinglecell.Theadvantageofthisapproachisobvious…However,identificationofproteinisverydifficultbecausetheamountofproteininsinglecellisreallyrear,anditseemsnowaytobecoupledtomassspectrometry.2-189Atthebiochemicallevel,proteinsrarelyactalone,butratherinteractwithoneanother,sometimesincomplexes,tocarryoutspecificcellularprocesses.Twohybridsystems:(+)pairwise/binaryinteractionsbetweenproteins;transientassociatio