微专题基因工程热点突破基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

微专题：基因工程中几个热点分析①限制酶的选择②

PCR影响因素分析③PCR热点应用问题④基因编辑

(同源替换

、CRISPR/Cas9系统、Cre/loxP酶系统）⑤酶切片段长度分析、酶切电泳遗传学分析

（电泳图谱分析）限制酶的选择[限制酶的选择原则概括]a.有其识别序列，且两方能得到相同末端(相同酶或同尾酶)b.质粒上该切点应该位于启动子下游、终止子上游c.不破坏目的基因d.不破坏质粒完整性（即不能同时有一种限制酶的多个切点）e.不破坏质粒上的关键因子f.尽量双酶切（避免自我成环和反向连接）(但要确保质粒上也有这两种酶或同尾酶的切割位点)。g.双酶切点间尽量靠近，不丢失重要序列h.避免无效切割（即切割点内含另一种酶的切割点）i.农杆菌转化法中，酶切点应该位于T-DNA内部限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，且在质粒上也存在该切点或同尾酶切点。如图甲可选择Pst。②不能破坏目的基因（切割位点不能位于目的基因内部）

如图甲乙丙丁都不能选择SmaⅠ。限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类③尽量使用双酶切（为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接）(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。④避免无效切割（切割点内含另一种同时使用的酶的切割点）★此时必须明确限制酶切割序列，参考启动子方向、目的基因上下游等综合分析EcoRI和BamHI?避免无效切割【微专题】限制酶的选择技巧(2)根据质粒的结构、功能特点确定限制酶的种类①质粒上该切点应该位于启动子下游、终止子上游（还要考虑目的基因方向与启动子方向）②不破坏质粒完整性（即不能同时有一种限制酶的多个切点）③不破坏质粒上的关键因子④双酶切点间尽量靠近，不丢失重要序列EcoRI和HindIII【微专题】限制酶的选择技巧(3)农杆菌转化法中，酶切点应该位于Ti质粒的T-DNA内部。如下图中甲、乙、丁的Ti质粒均不宜选取，而丙的Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。【例1】限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—CT↓TAAGC—和—G↓AATTC—,下图表示目的基因和四种质粒，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(

)A【例2】目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为______________________。(2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是_____________。限制酶和DNA连接酶SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因(3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致________________________________________________等问题，为避免以上问题出现，应使用____________________________________________两种限制酶。(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上________，其是______________识别和结合的部位。目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)启动子RNA聚合酶【例3】(不定项)某实验小组利用下图所示的质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是(

)A.图中的质粒用酶A切割后，会产生4个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因C.成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长D.若用酶B和酶C切割，可以避免质粒的自身环化AD【例4】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—，根据图示分析下列叙述正确的是(

)A.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同D.质粒中标记基因的作用是便于筛选出目的基因已经表达的细胞

B【例5】下面是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（）A.以上DNA片段由4种限制酶切割后产生B.②片段是在识别序列为

的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在T4DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子D.限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用的部位都是磷酸二酯键BA.构建基因表达载体时,用MfeI、HindⅢ切割质粒,用EcoRI、HindⅢ切割目的基因B.THP9基因有2个游离的磷酸基团,而且游离的磷酸基团在3端C.利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4D.为检测转基因玉米新品种的培育是否成功,需要在个体水平上检测THP9基因是否表达出蛋白质【例6】THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因,研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内,从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述正确的是（

）A【例7】工业生产奶酪需要添加凝乳酶使牛奶中的蛋白质凝聚固化。传统的制备凝乳酶的方法是通过杀死未断奶的小牛，然后将第四胃的黏膜取出来进行提取，目前此法已不能满足日益增长的市场需求。研究人员制备了一种膀胱生物反应器来生产牛凝乳酶，下图为所用载体及牛凝乳酶cDNA示意图。(1)牛凝乳酶cDNA中P1的左侧有RNA聚合酶识别和结合的位点，为实现牛凝乳酶基因与载体定向连接，PCR扩增设计引物时需在引物的5’端添加相应的限制酶识别序列。据图分析，应选择的引物及其对应的限制酶为:P2P3BamHI【例7】工业生产奶酪需要添加凝乳酶使牛奶中的蛋白质凝聚固化。传统的制备凝乳酶的方法是通过杀死未断奶的小牛，然后将第四胃的黏膜取出来进行提取，目前此法已不能满足日益增长的市场需求。研究人员制备了一种膀胱生物反应器来生产牛凝乳酶，下图为所用载体及牛凝乳酶cDNA示意图。（2）构建基因表达载体时，先用

切割质粒，然后用

(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)进行连接。(3)构建基因表达载体时需要选择的启动子是膀胱上皮细胞蛋白基因的启动子，目的是

。EcoRV和BamHIT4DNA连接酶能在膀胱上皮细胞内特异性表达【例8】用

DNA

连接酶把被限制酶

l(识别序列和切点是-↓GATC-)切割过的运载体和被限制酶Ⅱ(识别序列和切点是-G↓GATC-)切割过的目的基因连接起来后,该重组

DNA

分子能够再被限制酶Ⅱ切割开的概率是:（

）A.1/2

B.7/16

C.1/16

D.1/4B2PCR影响因素分析【讨论】若只复制某DNA中的某一段目标片段1.引物间有互补序列，引物自身有回文结构会造成什么结果？2.引物浓度低会造成什么影响？3.引物过短会造成什么影响？4.复性（退火）温度对结果有什么影响？特异性差温度过低，特异性差，出现非特异性产物温度过高，难结合，效率低、产量低效率低效率低，或失败【能力拔高】PCR影响因素深度分析[思维拓展]变性、复性（退火）温度对PCR的影响变性温度过低，变性不彻底或迅速复性，降低产量变性温度过高，DNA聚合酶活性降低甚至失活，降低产量复性温度过低，引物与模板造成与其他基因的错配，特异性降低，出现分特异性扩增产物复性温度过高，引物不能与模板紧密结合，扩增效率降低，降低产量[思维拓展]

PCR温度、时间的选择复性（退火）温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物长度越短，引物中G+C的含量越低，所需的复性温度越低。根据扩增的长度适当下调复性（退火）温度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（熔解温度）=4（G+C）+2（A+T）变性温度=Tm值ⅹ2复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。【讨论】若只复制某DNA中的某一段目标片段1.引物间有互补序列，引物自身有回文结构会造成什么结果？2.引物浓度低会造成什么影响？3.引物过短会造成什么影响？4.复性（退火）温度对结果有什么影响？特异性差温度过低，特异性差，出现非特异性产物温度过高，难结合，效率低、产量低效率低效率低，或失败5.Mg2+浓度对PCR结果有什么影响？反向PCR【能力拔高】PCR深度分析及变式应用[提醒]练习中积累RT-PCR、实时荧光PCR（荧光定量PCR）、重叠延伸PCR、大引物PCR、不对称PCR等过低，效率低、产量低过高，特异性差，出现非特异性产物6.如果没有得到目的基因两端的引物，如何设计能进行完整的的PCR？3PCR热点应用问题（含基因定位）1.扩增DNA片段（从DNA分子中扩增特定片段——引物的选取）2.DNA测序（分别以4对ddNTP、dNTP为原料，PCR得到特定碱基为末端的片段，电泳分析）3.DNA检测（只检测存在与否用荧光PCR，若检测量进行实时荧光定量PCR）RNA检测（RT-PCR，只检测存在与否用荧光PCR，若检测量进行实时荧光定量PCR）4.扩增并在5’端修饰限制酶位点或启动子序列（需要设计引物，在两种引物5’端加限制酶识别序列或启动子序列）5.扩增未知序列（反向PCR，利用已有已知序列或修饰上已知片段后，对已知序列两侧的未知序列PCR）6.DNA片段拼接（重叠PCR）7.大分子扩增（重叠PCR）8.定点突变（在引物对应目的基因内部区域，设计个别碱基与模板不配对碱基。引物5’端修饰、重叠延伸PCR、大引物PCR）9.重组DNA（交错延伸PCR）10.获得大量单链探针（不对称PCR）11.提高产物特异性（递减PCR、巢式PCR、降落伞PCR缩小范围海选）12.基因定位（系列引物PCR，转基因表达检测）1.DNA片段扩增获取目的基因略2.DN测序PCR应用类型简介（含基因定位）5’

3’AGCTTCAGTC……TCGTCGAAGTCGAAGTCAG电泳分离PCR应用类型简介（含基因定位）dGTPddGTPTCGTCGAAGdGTPddGTPTCGAAGTCAGdGTPddGTP5’

3’子链5’3’TCGAAGTAGC被测5’CCTGACTTCGATGAAGGTCAAGCTTCAGTCPCR应用类型简介（含基因定位）PCR应用类型简介（含基因定位）1.DNA片段扩增获取目的基因略2.DNA测序分4组PCR，都含有4种dNTP，每组一种ddNTP，即每组4+1原料得到特定碱基为末端的片段电泳分析，或电泳后检测荧光图谱【进一步拓展】1.化学法DNA测序DNA末端标记，再对某种碱基进行化学处理（如甲基化、N化、环化、去除）等，使DNA序列在特定部位断裂（类似于ddNTP处理)2.自动化测序原理同PCR链终止法，只是用不同颜色荧光标记不同ddNTP，在一个泳道中直接得到四色图谱曲线3.芯片测序PCR应用类型简介（含基因定位）[例]基因检测是指通过检测生物体中的DNA序列,以了解生物体基因状况的技术于段。Sanger双脱氧链终止法是DNA测序的基本方法,其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、带有3'-OH末端的单链核苷酸引物、四种dNTP存在的条件下复制或转录时,如果在反应系统中分别引人单一种类的ddNTP(即2,3双脱氧核苷三磷酸,在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键),只要ddNTP参入链端,该链就停止延长,链端掺入dNTP的片段可继续延长。通过电泳将不同长度的片段分开,DNA片段越小,距离起点越远,根据末端核苷酸可得到原始序列信息。具体流程如图。(1)若待测核酸模板为双链DNA,首先要作

处理,与引物结合后,在DNA聚合酶作用下子链沿

方向(填“5"端向3'端”或“3'端向S'端”)进行延伸反应。若待测核酸模板为RNA,则需要在

酶的帮助下合成DNA单链片段。(2)ddNTP为2,3-双脱氧核苷三磷酸,只要ddNTP接入链端,该链就停止延长的原因是

.

(3)假设某反应体系中,待测DNA单链序列3‘-GTACCCTA-5’,加人4种dNTP和ddATP,经过双脱氧链终止法处理,会得到

种片段,其中最短的片段序列是

。

(4)假设某次Sanger双脱氧链终止法测序得到的电泳图如上图所示,则待测DNA序列从5‘端到3’端为_

。

新链：3‘-TACCAGTAGT-5‘变性

5'端向3'端逆转录3号碳上不是羟基，不能与下一个脱氧核苷酸的磷酸基团形成磷酸二酯键3CddA5‘-ATGGTCATCA-3‘[思维拓展]

如何鉴定DNA分子结构的改变(基因突变)？DNA测序DNA分子杂交PCR+电泳CT值大小，反映测定初始的核酸浓度3.DNA检测、RNA检测PCR应用类型简介（含基因定位）DNA检测：只检测存在与否用电泳检测，若检测量进行实时荧光定量PCR）RNA检测：RT-PCR，只检测存在与否电泳检测，若检测量进行实时荧光定量PCR）重要应用：检测表达水平[例]实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发岀的淬灭基团，新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发岀荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是()A.RT-PCR技术需要用到逆转录酶和Taq酶

B.PCR过程中需加入两种引物和4种dNTPC.引物和探针都需与目的基因进行碱基互补配对

D.若检测结果没有荧光发岀，说明被检测者感染了病毒D4.扩增并在5’端修饰限制酶位点或启动子序列PCR应用类型简介（含基因定位）需要设计引物，在两种引物5’端加限制酶识别序列或启动子序列或做首端突变）①②链完成[例](多选)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是(

)A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq酶等C.第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2AC5.扩增未知序列——反向PCRPCR应用类型简介（含基因定位）（利用已有已知序列，对已知序列两侧的未知序列PCR）【素材】反向PCR——与已知片段的引物相反，扩增未知序列片段（因为DNA聚合酶必须从引物3’端开始延伸子链DNA）★此法也可以对未知目的基因末端序列情况下对目的基因进行扩增（在其中部插入已知片段进行反向PCR），但不如两端修饰已知序列更简单。★此法PCR直接产物不是原来顺序，需要进一步测序分析或酶切恢复复原来顺序待测未知序列同种酶A剪切连接成环已知序列插入已知序列连接为将来设计引物同种酶B剪切两端3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’设计引物当初各切点序列都已知，可以再切割、连接得到大量未知序列的拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’引物a5’3’引物b3’5’引物b3’5’引物a5’3’5’3’5’3’引物b3’5’引物a5’3’PCR[例]反向PCR可扩增已知序列两端的未知序列。如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想对T-DNA两侧的未知序列进行扩增，下列做法正确的是(

)A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增

B.用限制酶酶切后连接成环状DNA，再用引物①④进行PCR扩增C.用引物②和引物③直接进行PCR扩增

D.用限制酶酶切后连接成环状DNA，再用引物②③进行PCR扩增C6.

DNA片段拼接——重叠PCRPCR应用类型简介（含基因定位）互为引物末端修饰①④②③7.大分子DNA扩增——重叠PCRPCR应用类型简介（含基因定位）【素材】重叠PCR——分子过大PCR很难成功，需要分成两段分别PCR，只要存在一定互补序列（搭桥），可以最后再连接成完整大片段。或进行定点突变或目的基因修饰酶切位点修饰。两个反应体系[例]重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点突变等方面具有广泛的应用前景。如图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列分析不正确的是(

)A.第一阶段过程中的产物是依赖引物1、2和引物3、4扩增的结果B.引物2和引物3上不能含有与模板链不能互补的碱基C.PCR过程中需要先加热至90℃以上再冷却至50℃左右D.第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因B

8.定点突变1——引物修饰PCR应用类型简介（含基因定位）（在引物对应目的基因内部区域，设计个别碱基与模板不配对碱基的引物）（4中引物5’端修饰，就是使基因末端序列突变）（1）——引物5’端修饰8.定点突变PCR应用类型简介（含基因定位）（2）——重叠延伸PCR两个PCR体系混合杂交互为引物延伸普通PCR该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。①分别利用引物F和Rm，引物Fm和R进行PCR②得到的DNA片段可以通过引物互补的碱基杂交在一起，③再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。④最后，用引物F和R进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。8.定点突变PCR应用类型简介（含基因定位）（在引物对应目的基因内部区域，设计个别碱基与模板不配对碱基的引物）（3）——大引物PCR大引物PCR需要用到三条引物（两条原备，一条PCR获得）进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。①第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段（即获得下游大引物）；②第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。非PCR定点突变不依赖PCR的定点突变技术的核心是人工合成带有突变位点的寡核苷酸片段，再借助在宿主细胞内的复制过程来实现定点突变。这类技术中比较成熟的有盒式突变、寡核苷酸引导的突变等。盒式突变的原理是，利用一段人工合成的含有突变位点的双链寡核苷酸片段来替换目的基因中相应的片段，从而在目的基因中引人突变位点。寡核苷酸引导的突变的技术流程如图3-11所示。[2]首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段(除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对);然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体(通常由M13噬菌体衍生而来)进行杂交;继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体;最后将双链载体引人宿主细胞进行复制，并进行选和鉴定9.重组DNA——交错延伸PCRPCR应用类型简介（含基因定位）交错延伸(staggerextensionprocess,StEP)是在一个PCR反应体系中，以两个以上相关的DNA片段（即同源性DNA）为模板进行PCR反应，引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性的过程。在每一轮PCR循环中，之前延伸的小片段均会随机的与一个模板碱基互补配对继续延伸，由于模板的转换而实现不同模板间的重组，最终实现全长基因片段的获得。（每一轮只复制一段就停止）基本步骤为：1）变性模板链与引物结合2）短暂延伸形成小片段3）另一循环时，小片段与模板随机结合作为引物（templateswitching）并继续延伸（退火温度应该稍低，毕竟特异性在降低）4）重复上述过程直至全长基因形成即最终得到新组合的基因得到大量突变体组合体10.获得大量DNA单链探针——不对称PCRPCR应用类型简介（含基因定位）【素材】不对称PCR正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物，那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫不对称PCR，主要只扩增一条模板链。通常用于获得大量的单链模板。实际操作时，为了增加模板量，也可以加入一对引物，只是两条引物在浓度上应存在差异。可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物

______个，需要非限制性引物

个。因为双链DNA和单链DNA的

不同，可通过电泳方法将其分离。（210-1）a

（

21⨉210-1）a

相对分子质量（分子大小）[例]不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50～1：100，在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物

__

___个，需要非限制性引物

______

个。因为双链DNA和单链DNA的

______

不同，可通过电泳方法将其分离。（

21⨉210-1）a

相对分子质量（碱基数量）（210-1）a11.提高产物特异性——降落伞PCR（递减PCR）、巢式PCRPCR应用类型简介（含基因定位）2.巢式PCR先用一对引物（位于模板外侧）完成15~20个循环的扩增，将产物稀释后作为模板进行第二轮PCR，所用引物位于第一对引物的内侧。即巢式PCR共使用的两对引物，进行了两轮PCR。第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物，所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度。可用于极少量DNA模板的扩增1.递减PCR开始先设定一个比较高的复性温度，每个循环复性温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的复性温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳复性温度的工作。12.基因定位PCR应用类型简介（含基因定位）（系列引物PCR，分片段PCR，分析碱基对的增添[例]亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880kb至～903kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示，下列说法错误的是（

）A.应提取该突变体和野生型亚洲棉的8号染色体的～880kb至～903kb区间DNA进行PCRB.上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的C.据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小D.该突变体出现的原因是第6对引物对应区间发生了基因突变的替换类型DPCR应用类型简介（含基因定位）[例]下图用F1—F7和R多组引物，确定启动子中某关键作用序列4基因编辑简介（

同源替换

、CRISPR/Cas9系统、Cre/loxP酶系统）1.同源重组法同源重组法替换、敲除基因、基因修饰编辑。是基于基因在自然界中的重组现象——交叉互换，利用目标片段两端与替换序列两端存在同源序列，发生交叉互换成功插入利用特定复合物CRISPR/Cas9系统，通过RNA与特定DNA片段结合，由蛋白质（相当于限制酶，只不过不是它识别特定序列，而是由我们设计的RNA执行）切割，以达到替换、敲除、修饰、修复原有基因序列的目的。2.

CRISPR/Cas9系统编辑3.

Cre/loxP酶系统编辑Cre与特定启动子结合发挥作用，诱导剪切，方便可控特定删除两个loxP序列之间的DNA序列。选择性表达(1)一个Loxp位点被Cre重组酶切割后会水解2个磷酸二酯键。请画出载体A被Cre重组酶切割后产生的黏性末端【对位练】Cre重组酶最早于1981年在P1菌体中发现，该酶由343个氨基酸组成，除了拥有催化活性外,同时还可以识别特定序列Loxp位点,该位点同样在P1菌体中被发现，序列长度为34bp。【对位练】Cre重组酶最早于1981年在P1菌体中发现，该酶由343个氨基酸组成，除了拥有催化活性外,同时还可以识别特定序列Loxp位点,该位点同样在P1菌体中被发现，序列长度为34bp。A两个末端互补但不相同A’A’AA’AA’A’(2)在目的基因两端加上Loxp序列后,有助于将目的基因与载体重组。利用PCR技术对目的基因B改造，关键是引物的设计，引物的作用是_。其中途径_(填写“①”或“②”)，得到的改造后的目的基因能与载体A进行重组。①【对位练】Cre重组酶最早于1981年在P1菌体中发现，该酶由343个氨基酸组成，除了拥有催化活性外,同时还可以识别特定序列Loxp位点,该位点同样在P1菌体中被发现，序列长度为34bp。(3)利用上述方法构建目的基因B与载体A的重组载体需要使用的酶是_。这与使用同一种限制酶构建基因表达载体相比，前者具有的优点是防止质粒与目的基因反向链接不能防止自我成环A两个末端互补但不相同A’A’AA’AA’A’5酶切电泳遗传学分析酶切片段长度分析【例1】（不定项）苯丙酮尿症（PKU）是一种由致病基因决定的氨基酸代谢病，常造成新生儿神经系统损害而智力低下，下图1是某家族中该病的遗传系谱图。为避免再生下患儿，该家族成员去医院进行了基因检测，已知被检测的PKU基因为142bp（bp表示碱基对）。检测人员用特定限制酶酶切部分家庭成员（Ⅲ1、Ⅲ2、III3）的PKU基因，产生了大小不同的几种片段。结果如图2所示。下列叙述正确的是（)A.苯丙酮尿症是单基因遗传病，由一个基因决定B.若III2与III3近亲结婚，生一个患病孩子的概率是0C.III1的每个PKU基因中均有2个该特定限制酶的酶切位点D.该致病等位基因的出现是因为发生碱基对的缺失

PCR应用类型简介（含基因定位）PKU基因142bp隐性遗传aa42100Aa504250504250a1004210042AA504250aIII1III2III3【例1】（不定项）苯丙酮尿症（PKU）是一种由致病基因决定的氨基酸代谢病，常造成新生儿神经系统损害而智力低下，下图1是某家族中该病的遗传系谱图。为避免再生下患儿，该家族成员去医院进行了基因检测，已知被检测的PKU基因为142bp（bp表示碱基对）。检测人员用特定限制酶酶切部分家庭成员（Ⅲ1、Ⅲ2、III3）的PKU基因，产生了大小不同的几种片段。结果如图2所示。下列叙述正确的是（)A.苯丙酮尿症是单基因遗传病，由一个基因决定B.若III2与III3近亲结婚，生一个患病孩子的概率是0C.III1的每个PKU基因中均有2个该特定限制酶的酶切位点D.该致病等位基因的出现是因为发生碱基对的缺失

BCaaAAAa用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。【例2】甲型血友病是由X染色体上的隐性基因导致的遗传病(H对h为显性)。图1中两个家系都有血友病发病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一个性染色体组成是XXY的非血友病儿子(Ⅳ2),家系中的其他成员性染色体组成均正常。0(1)根据图1,

(填“能”或“不能”)确定Ⅳ2两条X染色体的来源;Ⅲ4与正常女子结婚,推断其女儿患血友病的概率是

。不能(2)两个家系的甲型血友病均由凝血因子Ⅷ(简称F8,即抗血友病球蛋白)基因碱基对缺失所致。为探明Ⅳ2的病因,对家系的第Ⅲ、Ⅳ代成员F8基因的特异片段进行了PCR扩增,其产物电泳结果如图2所示,结合图1,推断Ⅲ3的基因型是

。请用图解和必要的文字说明Ⅳ2非血友病XXY的形成原因。【例2】甲型血友病是由X染色体上的隐性基因导致的遗传病(H对h为显性)。图1中两个家系都有血友病发病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一个性染色体组成是XXY的非血友病儿子(Ⅳ2),家系中的其他成员性染色体组成均正常。XHXh在Ⅲ3形成卵细胞过程中的减数第二次分裂后期，带有基因H的姐妹染色单体移向细胞同一极，形成XHXH的卵细胞．XHXH的卵细胞与正常精子结合形成XHXH的受精卵．【例2】甲型血友病是由X染色体上的隐性基因导致的遗传病(H对h为显性)。图1中两个家系都有血友病发病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一个性染色体组成是XXY的非血友病儿子(Ⅳ2),家系中的其他成员性染色体组成均正常。(3)现Ⅲ3再次怀孕,产前诊断显示胎儿(Ⅳ3)细胞的染色体为46,XY;F8基因的PCR检测结果如图2所示。由此建议Ⅲ3

。终止妊娠【例3】A基因中含两种限制酶BamHI和MspI（5'C↓CGG3’）的酶切位点，HpaⅡ和MspI酶切位点相同，酶切位点处的胞嘧啶可能被甲基化，HpaⅡ对胞嘧啶甲基化敏感（即不能切割甲基化的酶切位点），而MspI则对胞嘧啶甲基化不敏感。某种小鼠（Aa）有两种表型，用每种表型的小鼠A基因分别做了三组的酶切实验：第一组单独使用BamHI，第二组使用BamHI+MspI，第三组使用BamHI+HpⅡ；每组完全酶切产物（每一个酶切位点均被切割）通过电泳分离并使用探针得到杂交带，如图所示。下列叙述错误的是（

）A.第一组处理后均可得到包含探针的8.9kb基因片段B.若表型1中的A基因经过第二组和第三组处理后的酶切结果分别是3.5kb和8.9kb，说明表型1中的A基因中四个MspI酶切位点均被甲基化C.若表型2中A基因第三组酶切结果介于3.5kb和8.9kb之间，说明A基因中至少有2个HpaⅡ酶切位点被甲基化D.该种小鼠（Aa）有两种表型可能是因为A基因甲基化程度不同影响了基因的表达C【例4】下图是构建基因表达载体示意图，请回答问题：(1)通过①过程获得的重组质粒含有4.9kb个碱基对，其中manA基因含有1.8kb个碱基对。现将该重组质粒成功导入受体细胞后，经培养，发现约有50%的细胞能正常表达目的基因产物，原因是

.(2)若用BamHI和EcoRI联合酶切割其中一种重组质粒，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段，若用上述联合酶切割同等长度的另一种重组质粒，则可获得

kb长度两种的DNA片段。目的基因与质粒连接时，有正向连接和反向连接两种结果1.4和3.5【典例5】回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。在图所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。（1）若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为

；含3.6kb质粒的细胞颜色为

。白色白色和蓝色/白色或蓝色

（2）若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为

kb。1.8【典例5】回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。（3）上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得

kb和

kb两种DNA片段。1.43.5【典例5】回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。（4）用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限