基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修32

生物学（人教版）选择性必修三

生物技术与工程第2节基因工程的基本操作程序第三章基因工程1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？从社会中来▲

普通棉桃（左）和转基因抗虫棉桃（右）抗虫机制：转基因抗虫棉的抗虫机制及培育过程Bt抗虫蛋白赋予棉花抗虫能力苏云金杆菌Bt抗虫蛋白破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫培育过程：苏云金杆菌Bt

抗虫蛋白基因提取与载体拼接导入棉花细胞抗虫棉表达目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的筛选与获取用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。1.目的基因：主要是编码特定蛋白质的基因也可以是具有调控作用的因子如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因第一步：目的基因的筛选与获取2.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因。

如可以利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。问题：筛选出来的目的基因如何获取呢？第一步：目的基因的筛选与获取3.获取目的基因的方法：（1）人工合成目的基因

在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段。▲DNA合成仪注：仅适用于较短的DNA。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。第一步：目的基因的筛选与获取（2）从基因文库中获取供体生物基因组DNADNA片段限制酶酶切与载体重组导入mRNA逆转录cDNA与载体重组导入基因组文库cDNA文库基因文库提取提取第一步：目的基因的筛选与获取（3）利用

PCR

特异性地快速扩增目的基因①概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。②原理：DNA半保留复制③优点：可以短时间内大量扩增目的基因凯利·穆里斯（1944.12-20198.7）④条件：第一步：目的基因的筛选与获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链维持pH稳定激活DNA聚合酶使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸（实为dNTP）DNA聚合酶缓冲物质Mg2+引物（短的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA母链4种脱氧核苷酸（实为dNTP）耐高温的DNA聚合酶缓冲液Mg2+引物（2种，短的单链DNA）第一步：目的基因的筛选与获取相关信息——

dNTPdNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简图如下：PPP～～N脱氧核糖ATGC脱氧核苷酸dNTP还能为子链合成供能。解旋RNA引物冈崎片段▲

体内DNA复制过程（部分）3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'第一步：目的基因的筛选与获取相关信息——引物

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，必须由引物提供3'端之后才能开始连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反向平行的，所以PCR需要

2种引物。引物的作用：使DNA聚合酶能从引物的3'开始连接脱氧核苷酸，启动DNA的复制。注：PCR中的引物为短单链DNA，通常含20~30个核苷酸。3'5'5'3'5'3'3'5'目的基因待扩增的DNA片段第一步：目的基因的筛选与获取⑤过程：当温度上升到

90℃

以上时，双链DNA解聚为单链。变性5'3'3'5'复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。5'3'3'5'延伸温度升至72℃左右，溶液中4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下连接成新的DNA链。3'5'5'3'5'3'引物A5'3'引物B第一次循环的产物思考·讨论第一步：目的基因的筛选与获取第二次循环的产物3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'1.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？不是；扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段；引物是根据目的基因两端的（或两条链3'部分）核苷酸序列来设计的。第一步：目的基因的筛选与获取第二次循环的产物3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'2.在以上的PCR扩增过程中，扩增1次共消耗几对引物？扩增2次呢？扩增3次呢？扩增n次呢？1对；3对；7对；2n-1对。思考·讨论第一步：目的基因的筛选与获取第二次循环的产物3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3.在以上的PCR扩增过程中，第几轮扩增产物中开始出现两条链等长的DNA片段（即目的基因）？有几个？其下一轮产物中这样的DNA片段又有几个？第n次呢？第3轮；2个；8个；2n-2n。✔✔思考·讨论思考·讨论4.下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），请据图分析两组引物是否合理并分别说明理由。都不合理；引物Ⅰ和引物Ⅱ之间会因局部发生碱基互补配对而失效；引物

A自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。CAGGCTAGCCTG引物Ⅰ引物Ⅱ第1组AACTGCAGTTCGACTGATTA引物A引物B第2组5'3'5'3'5'3'5'3'思考·讨论5.若引物较短，引物是否会与非目的基因序列进行配对？引物较长呢？这会导致什么结果？这给我们设计引物时有何启发？3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'引物过短或过长都有可能与非目的基因序列进行配对，

从而导致扩增出非目的基因序列（或者说出现非特异性扩增）。为了确保PCR只是对目的基因进行扩增，这就要求引物既不能太短，也不能太长。“模糊配对”思考·讨论6.怎样确保在复性时是引物与模板配对结合，而不是模板链之间配对结合呢？3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'只要引物是过量的，模板与引物配对结合的概率就特别高，就能保证复性时是引物和模板链配对结合。思考·讨论7.温度越低越有利于氢键的形成，那么复性时温度设置低一些是不是更好呢？5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'“模糊配对”“精确配对”5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'“精确配对”较低温度下，“模糊配对”和“精确配对”均能形成稳定结构较高温度下，“模糊配对”难以形成稳定结构，“精确配对”可以为了降低引物与目的序列结合的概率以及后续的非特异性扩增，通常不会将复性温度设计的很低。思考·讨论8.复性的温度与引物有关吗？如果有，体现在哪些方面？复性时的温度与引物的关系主要体现在复性温度的选择会直接影响引物与模板DNA的结合效率和特异性‌。复性温度的选择取决于引物的长度、GC含量及靶基因序列的特性‌等。当引物较长或GC含量较多的情况下，引物与模板DNA之间非特异性结合概率增加，为提高引物与模板之间有效结合率，可适当增加复性温度。第一步：目的基因的筛选与获取⑥引物设计要求：a.引物自身不能环化（即引物自身内部不能形成局部双链）b.两种引物之间不能互补配对c.引物长度不宜过短或过长，防止出现引物与模板的非特异性结合d.引物的GC含量不宜太高（通常建议在40%-60%之间），且两种引物之间GC含量（或比例）要相当，以免出现复性温度不统一⑦结果与鉴定：结果：成指数形式扩增（约为

2n，其中n为扩增循环的次数）鉴定：PCR的产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定获取了足够量的

Bt

基因后，能不能直接将它导入受体细胞呢？不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。第二步：基因表达载体的构建1.目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。第二步：基因表达载体的构建2.组成：基因表达载体标记基因复制原点终止子启动子插入目的基因位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNADNA复制的起始位点人们所需要的基因位于基因的下游；终止转录便于重组DNA分子的筛选（将含有目的基因的受体细胞筛选出来）非编码区非编码区原核生物基因启动子终止子编码区非编码区非编码区真核生物基因启动子终止子编码区外显子内含子【拓展延伸】真、原核生物基因的结构及转录和加工过程转

录前体mRNA加

工成熟mRNA转

录mRNA注意：启动子和终止子都是DNA序列，而起始密码子和终止密码子则位于mRNA上，分别是翻译的起点和终点。【拓展延伸】启动子的类型（根据转录模式分）①组成型启动子

这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子

其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。③诱导型启动子

当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。第二步：基因表达载体的构建3.构建过程：用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。1用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。2用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。3分析基因表达载体构建的方法（1）构建基因表达载体时，能否用

Sma

Ⅰ限制酶切割质粒？为什么？不能；因为

SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组DNA分子）。质粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ图1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA图2分析基因表达载体构建的方法（2）若只用

EcoR

Ⅰ限制酶切质粒和外源DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？质粒自身环化正向连接反向连接目的基因多拷贝与质粒连接质粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ图1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA图2分析基因表达载体构建的方法（3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源DNA进行切割？使用

BamHⅠ和

HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA。质粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ图1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA图2优点：①避免质粒自身环化；②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。双酶切法分析基因表达载体构建的方法问题：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'3'3'3'5'3'3'5'3'3'5'3'3'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'3'5'3'3'引入限制酶识别序列第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞的方法，因为受体细胞的不同而有所区别。1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.导入方法：实质：将目的基因整合到受体细胞基因组中。花粉管通道法（我国科学家独创）农杆菌转化法（常用）导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞显微注射法Ca2+处理法第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞——花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。1在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。2导入受精卵第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞——农杆菌转化法（1）农杆菌的特点：①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），而对大多数单子叶植物没有侵染能力。不过随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。②农杆菌细胞内含有

Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的

T-DNA

（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。Ti质粒T-DNA第三步：将目的基因导入受体细胞Ti质粒T-DNA目的基因构建表达载体（2）过程：含目的基因重组Ti质粒含重组Ti质粒的农杆菌将目的基因插入染色体DNA中植物细胞转入农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植株植物组织培养①切下植物叶片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞（受体细胞——体细胞）；②将花序培养在农杆菌溶液中，获得种子后筛选、鉴定（受体细胞——受精卵）。第1次拼接第2次拼接第1次导入第2次导入第三步：将目的基因导入受体细胞导入动物细胞——显微注射法▲

显微注射仪▲

将目的基因注射到动物受精卵中（1）受体细胞：受精卵（2）操作程序：将目的基因的表达载体提纯显微注射受精卵发育具有新性状的动物①个体大，易操作；②受精卵全能性高，易培养成完整个体。第三步：将目的基因导入受体细胞导入微生物细胞——Ca2+处理法大肠杆菌Ca2+表达载体▲

Ca2+处理法示意图（1）原核生物作为受体细胞的优点：繁殖周期短、体积小易于培养操作、多为单细胞、遗传物质相对较少等（2）操作过程：Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子一种能吸收周围环境中

DNA分子的生理状态原核生物作为受体细胞产生真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要进一步加工。分析将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定基因表达载体中已经具备标记基因（如抗生素抗性基因），对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？

在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。

此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。第四步：目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测（1）检测目的基因是否导入——

通过PCR等技术检测如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了

Bt

基因提取DNA转基因棉花PCR是否扩增出目的基因利用

Bt基因的核苷酸序列设计引物M：marker1-6：转基因棉花7：非转基因棉花8：阴性对照电泳第四步：目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测（2）检测目的基因是否转录——

通过PCR等技术检测如：检测

Bt

基因是否转录出mRNA提取棉花细胞mRNA逆转录得到cDNA用以

Bt

基因序列设计的引物进行PCR扩增电泳检测BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株

Bt基因发生转录第四步：目的基因的检测与鉴定拓展延伸——还可利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录基因探针：一段带有检测标记（荧光或同位素标记）且顺序已知的与目的基因能互补的核酸序列（DNA

或

RNA）。检测方法：将待测DNA或RNA与基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。DNA分子杂交第四步：目的基因的检测与鉴定拓展延伸——还可利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录基因探针：一段带有检测标记（荧光或同位素标记）且顺序已知的与目的基因能互补的核酸序列（DNA

或

RNA）。检测方法：将待测DNA或RNA与基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。DNA分子杂交分子杂交第四步：目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测（3）检测目的基因是否翻译——

通过抗原-抗体杂交检测如：检测

Bt

基因是否翻译成Bt抗虫蛋白苏云金杆菌提取Bt毒蛋白注射抗体标记抗体转基因棉花提取蛋白电泳分离抗原-抗体杂交第四步：目的基因的检测与鉴定2.个体生物学水平的鉴定抗虫植物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡抗盐植物抗除草剂植物抗病毒（菌）植物获取目的基因产物的转基因生物用一定浓度盐水浇灌正常生长鉴定方法成功标志喷洒除草剂正常生长病毒（菌）接种实验未染病提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常——

抗性鉴定、活性鉴定等基因工程的基本操作流程图获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性探究·实践DNA片段的扩增及电泳1.实验原理：（1）DNA片段的扩增PCR利用了

DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。一次PCR一般要经历30次循环。（2）DNA片段的电泳鉴定DNA在一定的pH下会带上电荷，带电的DNA会在电场的作用下向所带电荷相反的电极移动，即电泳。PCR产物一般用琼脂糖凝胶电泳鉴定，其在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象（如链状和环状）等有关。凝胶中的DNA通过染色，可在300nm紫外灯下被检测出来。探究·实践DNA片段的扩增及电泳电源PCR仪微量离心管体积刻度吸液杆调节旋钮推动杆卸枪头按钮枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）微量移液器探究·实践DNA片段的扩增及电泳2.材料用具：琼脂糖凝胶电泳装置探究·实践DNA片段的扩增及电泳3.方法步骤：——DNA片段的扩增①PCR加样操作

按照右表，用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg②

离心

盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。探究·实践DNA片段的扩增及电泳③PCR

参照下表设置PCR循