实验二培养基的制备及灭菌

实验二培养基的制备及灭菌二、基本原理(一)培养基得制备原理培养基就是微生物生长、繁殖、代谢得混合养料。从营养角度分析:♪营养:碳源、氮源、生长因子、水分和无机盐等;♪适宜得酸碱度(pH值)和一定缓冲能力;♪一定得氧化还原电位;♪合适得渗透压。(二)灭菌原理1、干热灭菌原理干热就是指相对湿度在20％以下得高热。干热消毒灭菌就是由空气导热,传热效果较慢。一般繁殖体在干热80－100℃中经1小时可以杀死,芽孢需160－170℃经2小时方可杀死。2、干热灭菌操作步骤(1)在移液管尾部塞上少许棉花,然后用报纸条包好;用报纸条包好干燥得培养皿。(2)将待灭菌物品包扎好,均匀放入烘箱内,注意不要摆得太挤,以免妨碍气流流通。(3)开启电源,设定温度为160℃~170℃

,保持此温度1~2小时。(4)切断电源,待温度降至70℃以下时,打开箱门,取出灭菌物品。2、湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌

在密闭得蒸锅内,其中得蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水得沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0、1MPa得压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热得芽孢。高压蒸汽灭菌操作步骤(1)加水:直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。(2)装锅:把需灭菌得器物放入锅内,关严锅盖。(3)接通热源:将锅盖上排气阀关闭,同时打开底部排气阀。待见有大量水汽排出时,维持3～5min,关上底部排气阀。(4)升压、升温:

关闭排气阀以后,锅内成为密闭系统,蒸汽不断增多,压力计和温度计得指针上升,当压力达到1、05kg/cm2(温度为121℃)即灭菌开始,这时维持在1、05kg/cm2,20～30min。除含糖培养基用0、56kg/cm2压力外,一般都用1、05kg/cm2压力。(5)切断电源:

达到灭菌时间要求后停止加热,任其自然降压,当指针回到0时,打开排气阀。高压蒸汽灭菌操作步骤10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流(6)揭开锅盖,取出灭菌物,排掉锅内剩余水。(7)待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h,若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。高压蒸汽灭菌操作步骤注意事项！(1)灭菌物不要装得太满,否则灭菌不彻底。(2)盖上锅盖,以两两对称方式同时旋紧螺栓,勿使漏气。(3)排气阀不能过早打开,否则培养基因压力突降,温度没下降会使培养基翻腾冲到棉塞处,既损失培养基又沾污了棉塞。三、实验器材1、药品:琼脂,10％HCL(各组自配),10%NaOH(各组自配),牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基和马铃薯葡萄糖(蔗糖)琼脂培养基(PDA)得配方药品。2、材料:刻度1000mL塘瓷量杯,天平,试管,量筒,小烧杯,玻璃棒,药匙,pH试纸,棉花,报纸,麻绳,标签,培养皿等。3、设备:高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。四、实验方法及步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基得制备

1、称量2、溶解3、调pH4、过滤5、分装6、加塞7、包扎8、灭菌9、搁置斜面10、无菌检查步骤牛肉膏3g

蛋白胨10gNaCl5g

琼脂20g

水1000mLpH7.4~7.6

配方1、称量按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错。3、调pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基得原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7、6,反之,则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子得浓度。对于有些要求pH值较精确得微生物,其pH得调节可用酸度计进行。4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利结果得观察。一般无特殊要求得情况下,这一步可以省去。2、溶解在上述烧杯中可先加入少于所需要得水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需得总体积。如果配制固体培养基,将称好得琼脂放入已溶化得药品中,再加热溶化,在琼脂溶化得过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失得水分。

5、分装按实验要求,可将配制得培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度得1/4左右为宜。

(2)固体分装分装试管,其装量不超过管高得1/5,灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶得量以不超过三角烧瓶容积得一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度得1/3为宜,灭菌后垂直待凝。6、加塞培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好得通气性能。7、包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8、灭菌将上述培养基以121℃,20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。9、搁置斜面将灭菌得试管培养基冷至50℃左右,将试管棉塞端搁在玻棒上,搁置得斜面长度不要超过试管总长得一半。10、无菌检查为检查灭菌就是否彻底,需将灭菌得培养基放入37℃得温室中培养24-48小时。

(二)马铃薯(PDA)培养基得制备(真菌用)马铃薯200g蒸馏水1000mL蔗糖(葡萄糖)20gpH自然琼脂20g马铃薯汁制备:将马铃薯去皮,称量所需重量,切成小块,加水煮沸30min。用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉花)趁热过滤。滤液煮沸后加糖,用于培养霉菌得加入蔗糖,用于培养酵母菌得加入葡萄糖,再加入其她。其余同牛肉膏蛋白胨培养基得制备。(三)高氏I号培养基得制备(放线菌菌用)可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0、5gK2HPO4