免疫学应用技术 第三章免疫原制备和抗体纯化技术学习资料

第三章

免疫原制备和抗体纯化技术第一节抗原的提取与纯化一、抗原的提取二、抗原的分离与纯化三、纯化抗原的浓缩和保存四、纯化抗原的鉴定一、抗原的提取（一）组织细胞的破碎1、冷热交替法2、反复冻融法3、超声破碎法4、玻璃匀浆器法5、自溶法6、酶处理法（二）抗原的提取1、蛋白质和酶的提取2、核酸的提取1、蛋白质和酶的提取（1）水溶液提取：大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，其中稀盐和缓冲液对保持蛋白质的稳定性较好，溶解度大，是提取蛋白质常用的溶剂。一般多以0.02~0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液提取。提取液的pH值要保证在蛋白质稳定的范围内，通常在其等电点两侧。酸性蛋白在偏碱一侧，而碱性蛋白在偏酸一侧。为防止生物活性蛋白质变性，温度以在4度以下为宜。（2）有机溶剂提取：少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，如用70%-80%乙醇提取麸蛋白；用60%-70%酸性乙醇提取胰岛素；用丁醇提取一些与脂质结合较牢固的蛋白和酶类。2、核酸的提取RNA的提取DNA的分离与纯化DNA片段的分离与回收RNA的提取异硫氰酸胍是一类有效解偶剂，当细胞被它溶解后，蛋白质二级结构降解，核蛋白迅速与核酸解离。在4mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙醇存在下，RNA酶失活，可提取完整的总RNA。DNA的分离与纯化在SDS和EDTA溶液中，蛋白酶K消化细胞蛋白质，由SDS破坏核膜而使DNA施放入水溶液。其中EDTA整合钙离子、镁离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用，SDS还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白，并与蛋白质结合成为复合物使蛋白质变性而沉淀下来。酚-氯仿-异戊醇可使蛋白质进一步沉淀，使DNA纯化。二、抗原的分离与纯化（一）选择性沉淀（二）分子筛和离子交换层析（三）亲和层析三、纯化抗原的浓缩与保存（一）纯化抗原的浓缩1、吸收浓缩2、蒸发浓缩3、超滤浓缩三、纯化抗原的浓缩与保存（二）纯化抗原的保存浓缩抗原可于液态或干燥状态贮存，并应低温保存。液态贮存样品必须浓缩至一定浓度后才能封装储存，样品太稀时易引起生物大分子聚合变性。并应有严格的防腐措施，常用防腐剂有甲苯、氯仿、叠氮钠、硫柳汞等。常用的稳定剂有甘油、蔗糖等。可采用低温干燥的方法将抗原冻干保存。干燥制品较稳定，在0~4度条件下可保存数年。四、纯化抗原的鉴定纯化蛋白质抗原的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散，免疫电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质抗原浓度的定量测定可用双缩脲法或酚试剂法，亦可用紫外光吸收法。第二节人工免疫原的制备一、载体的类型二、偶联剂与连接方法一、载体的类型（一）蛋白质类载体人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）等（二）合成类载体多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸-S-甘油半胱氨酰-丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。二、偶联剂与连接方法常用的偶联方法有戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法、亚胺酸酯法和卤代硝基苯法等。这些偶联方法使半抗原与载体在-COOH、-NH2、或-SH等基团部位发生结合。对不具备-COOH、-NH2、或-SH等基团的半抗原，需要加以改造使其转变为带有氨基或羧基的衍生物后，方可偶联制备载体-半抗原。（一）O-（羧甲基）羟胺反应先将半抗原与O-（羧甲基）羟胺反应，形成带有COOH的连接物，其反应式如下：（二）混合酸酐反应又称氯甲酸异丁酯法，半抗原或带有羧基的衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼的中间体混合酸酐，然后与蛋白质载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键，多用于类固醇抗原的制备。混合酸酐反应过程在碱性条件下：半抗原-C=N-O-CH2-COOH+Cl-COOCH2CH(CH3)2半抗原-C=N-O-CH2-COO-COOCH2CH(CH3)2+HCl半抗原-C=N-O-CH2-COO-COOCH2CH(CH3)2+NH2-KLH半抗原-CO-NH-KLH二、偶联剂与连接方法在人工免疫原的制备过程中，应依据半抗原的性质不同选用不同的偶联剂和方法。主要是要求制备的人工抗原保持半抗原的结构特异性；所用交联方法不明显改变半抗原的结构特异性；所用交联方法不明显改变半抗原的结构，并保留半抗原的决定簇。抗原决定簇抗原决定簇，又称表位，是指抗原性物质表面决定该抗原特异性的特殊化学基团。抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础。抗原决定簇是很小的，其大小相当于相应抗体的结合部位。二、偶联剂与连接方法由于抗体的特异性主要是针对半抗原分子中远离偶联键的结构，因此，在设计人工抗原结合物时，应选择远离半抗原特征结构的基团进行交联。第三节合成肽抗原的制备一、肽的合成与纯化二、免疫原性肽的选择三、载体蛋白的选择四、连接方式的选择五、合成肽与载体蛋白的连接一、肽的合成与纯化肽的合成通常由专业实验室进行，肽的固相合成多采用叔丁氧（酰）羰基（t-BOC)和9-氟甲氧羰基（FMOC）化学法。合成肽的纯化常采用凝胶过滤层析（GF）及反向高效液相色谱（RP-HPLC）。二、免疫原性肽的选择免疫原性肽的选择是关系到能否获得特异性抗体的关键。（一）C-末端肽的选择由于蛋白质的C-末端比分子的其他部分移动性大，暴露于蛋白表面的频率高，常为抗体结合位点。如MHC-I、MHC-II类抗原及T细胞受体分子以其N-末端的Cys残基通过顺丁烯酰胺苯甲酸-N-瑚珀酸酯（MBS）作为偶联剂，可直接与载体连接。肽通过其N-末端与载体蛋白连接，类似于天然蛋白暴露的方式。（二）N-末端肽的选择N末端也常是暴露于天然蛋白表面的部分，因此，从N-末端选择的肽作为抗原，可制备与完整蛋白质反应的抗体。如果应用MBS法连接，则要求Cys残基在C-端。（三）内部肽序列的选择通过计算机预测极大可能性暴露于蛋白质表面的区域，可以帮助从蛋白质序列内部选择肽。但是必须知道蛋白质的一级结构。蛋白质与抗体反应的位点常暴露于蛋白质外部的亲水区。由此可通过计算机程序采用两种方法选择合成肽序列。此外，可根据二级结构推测选择内部肽序列。上述计算机程序及肽序列软件包称为PC基因库，由Intelligenetics提供。（四）肽的长度选择制备抗血清肽序列可根据下列原则：如有可能，尽量选择多个肽，如N-端肽和C-端肽。如果具有亲水性，且易与载体连接，可选用C-末端或N-末端序列7~15个残基。应用内部亲水区域，最好选用比较长的肽，15~20个残基。（五）选择肽的修饰肽的其他特性尽量与模拟的天然蛋白质类似。如果肽序列来源于天然蛋白的内部，游离的N-端氨基和C-端羧基应加以修饰，使其更接近于模拟的天然结构。在肽的合成过程中，N-端氨基可通过α-氨基乙酰化，以及C-端羧基酰胺化。通过这种修饰作用可以稳定合成肽的α螺旋构型及增加其溶解度。三、载体蛋白的选择载体蛋白除应具有较好的免疫原性外，还应具有足够的反应侧链氨基酸残基，以便与合成肽连接。最常用的蛋白载体有BSA、OVA、肌红蛋白、破伤风类毒素、KLH等。四、连接方法的选择大多数连接方式依赖于游离的氨基（赖氨酸）、巯基（半胱氨酸）、酚基（酪胺酸）、羧基（门冬氨酸或谷氨酸）的存在。四、连接方法的选择合成肽具有游离的巯基，蛋白载体具有游离氨基，则可应用MBS（顺丁烯酰胺苯甲酸-N-瑚珀酸酯）直接连接，但是在合成肽时其C-端或N-端必须加入半胱氨酸残基。来源于N-端序列的肽与载体蛋白连接可将一个半胱氨酸加入肽的C-端。来源于C-端序列的肽，以同样的方式将半胱氨酸加入肽的N-端。如果被选择的肽存在内部半胱氨酸残基，也可应用MBS连接。四、连接方法的选择如果某些原因不能通过MBS连接，如存在非末端半胱氨酸残基，则可应用重氮化对氨基联苯胺法（BDB）通过C-或N-端酪氨酸连接，碳化二亚胺法（EDCI）以C-或N-端连接，或戊二醛法通过N-端α-氨基连接。如果存在内部谷氨酸、门冬氨酸或赖氨酸残基，则不宜采用EDCI法连接，戊二醛法亦不适宜对内部赖氨酸残基的连接。五、合成肽与载体蛋白的连接（一）MBS连接法（二）戊二醛偶联法（三）EDCI（四）BDB连接法（一）MBS连接法MBS是目前已知最好的异双功能交联剂，在中性pH环境，将巯基组与氨基交联。第一步反应是通过载体蛋白与MBS连接，形成MBS/KLH连结物。层析纯化后，MBS/KLH与含Cys的合成肽交联。合成肽必须具有游离的-SH。（二）戊二醛偶联法戊二醛也是双功能偶联剂，它的两个醛基可分别与合成肽或半抗原和载体的氨基以共价键结合，将合成肽或半抗原与载体连接在一起，最好在肽的适当部位含有Lys残基。首先将KLH与肽混合，然后应用戊二醛法交联，以甘油封闭未反应戊二醛的作用。（三）EDCI法EDCI是一种化学性质和活泼的双功能试剂，其偶联反应既可在氨基部位，也可发生在羧基部位，将肽C-端羧基与载体游离的