基因工程的基本操作程序高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序本节聚焦1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？第一课时1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？例如：培育转基因抗虫棉的简要过程提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)基因工程的基本操作程序：获：目的基因的筛选与获取构：基因表达载体的构建导：将目的基因导入受体细胞检：目的基因的检测和鉴定（核心）

从社会中来一、目的基因的筛选与获取1、目的基因的概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因2.筛选合适的目的基因（1）已知结构和功能清晰（2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。测定：核酸和蛋白质序列查找：存储和共享在序列数据库中的碱基顺序或氨基酸残基顺序及其注释信息。比对：查询核酸序列（氨基酸序列）与数据库中的相似序列。提取苏云金芽孢杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因明确了目的基因后，该怎么获得它？3.目的基因的获取方法PCR基因文库适用于：较小且全部序列已知的目的基因。例：我国首批转基因抗虫棉的培育使用PCR基因扩增仪PCR技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。什么是PCR？4.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR:①原理、②操作环境、③目的①原理②操作环境③目的④优点：可以在短时间内大量扩增目的基因⑤实质：

在体外模拟体内DNA复制过程p77耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）②PCR条件:一.目的基因的筛选与获取四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶3.利用PCR获取和扩增目的基因什么是引物？引物的作用是什么？思考讨论定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）作用：引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端开始拼接单个的核苷酸进行PCR扩增。什么是引物？引物的作用是什么？（2）PCR扩增过程待扩增的DNA片段引物耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸变性温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。（2）PCR扩增过程第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。（3）PCR小结变性复性延伸温度：90℃以上过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链温度：50℃左右过程：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合温度：72℃左右过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的3’端，合成新的DNA链。反复循环结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数方式扩增，可以扩增出2n个DNA片段。（2）PCR扩增过程【典例】下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：(1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？

第3轮；1/4。(2)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？

不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？

根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。习题巩固1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同√如何对产物进行鉴定？思考讨论琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。通过比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。－最短最长Bt基因导入棉花细胞若将Bt基因直接导入棉花细胞不是更简便嘛？那么能否这么做？这么做会导致什么结果？？？

游离的DNA进入细胞体,一般会直接被分解,就算可以进行转录——翻译成蛋白,游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因能够直接导入⭐基因表达载体的构建——核心二、基因表达载体的构建1.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。基因的首端（一段有特殊结构的DNA片段）人们所需要的基因位置：功能：基因的尾端（一段特殊的DNA片断）终止mRNA的转录用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞基因表达载体的构建二启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别总结项目启动子终止子起始密码终止密码化学成分DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束

3.基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种基因表达载体的构建二培育抗虫棉的简要过程使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，减少自连情况出现；载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1如何解决这一问题？二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建②双酶切的优点A、防止质粒重新环化B、防止质粒与目的基因反向连接C、防止目的基因自身环化1.如图是利用基因工程技