乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的分析

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究缩略词表

缩略词表

英文缩写英文全称

BMIBodyMassIndex身体质量指数

BSHBilesalthydrolase胆酸盐水解酶

ClustersofOrthologousGroupsof

COG蛋白质直系同源簇

proteins

CTLscytotoxicTlymphocytes细胞毒素T淋巴细胞

ECEnzymeCommission酶学委员会

EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸

KyotoEncyclopediaofGenesand京都基因和基因组百科

K匕GG

Genomes全书美国国立生物技

术信息中心

NationalCenterforBiotechnology

NCRI

Information

PBMCPeripheralBloodMononuclearCell外周血单核细胞

PCAPrincipleComponentAnalysis主成分分析

PVPPPolyvinylpyrrolidone聚乙烯聚此咯烷酮

SBSSequencingbysynthesis边合成边测序

ShortOligonucleotideAlignment

SOAP短寡核甘酸组装程序

Program

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究中文摘要

摘要

人体作为一个超个体，其生理健康不仅会受到外界环境与自身基因的影

响，也会受到机体自身寄居微生物的影响。人体内的微生物组可以看做是一

个虚拟的器官，执行着机体的多种代谢功能。而人体大部分的细菌是寄居在

肠道的，肠道微生物基因组被誉为人类的“第二基因组”。

正常成年人结肠内pH在5.5〜7.0之间，并且肠道菌群结构趋于近似，拟

杆菌属占肠道菌群30%,而肠杆菌属和肠球菌属的含量少于1%。肠道中的专

性厌氧菌本身对于维持肠道菌群结构的平衡起着至关重要的作用，专性厌氧

菌作为肠道中的菌膜屏障，主要通过两种途径来阻止肠道潜在致病菌（通常

为兼性厌氧或需氧菌）及毒素在肠上皮细胞的粘附，其一，通过与肠上皮细

胞紧密结合，占据空间；其二，通过竞争营养物质，产生酸性代谢产物，降

低肠道pHo

据世界卫生组织的数据显示，全球每年约有60万人死于慢性HBV感染。

截止至2010年，中国有1.2亿人感染HBV。HBV侵袭肝脏后在肝细胞内复

制，从根本上损害肝脏功能，其诱导的机体适应性免疫应答会产生两种效果:

杀死肝细胞和清除HBV病毒，经过数年的迁延，发展为肝硬化。在我国，

肝硬化患者中血清HBVDNA阳性率高达76.7%o

肝硬化主要从以下三个方面影响肠道微环境：（1）门脉高压，导致静脉

回流受阻，胃肠道淤血，组织水肿，胃肠蠕动减慢，进一步引起肠道通透性

增加，pH值改变；（2）肝功能受损，导致胆汁酸分泌减少、对内毒素的清除

能力下降等，影响肠道菌群的结构和代谢；（3）宿主抵抗力降低。以上三个

因素共同作用，导致肠道微环境改变，肠道菌群失调。而在此影响下，乙肝

肝硬化患者肠道中具体发生了怎样的改变，目前还没有一个完整准确的认识。

宏基因组学的研究方法具有明显的优势，是解决这一问题的一个很好的

方法。宏基因组学是指直接提取环境样品中的宏基因组进行高通量测序和生

物信息学分析。传统微生物学以及微生物基因组学都是以可培养的微生物克

隆产物为基础的，而目前自然界中有大于99%的细菌在实验室无法检出，培

养的局限性使人们错过了捕捉众多微生物多样性的机会。由于宏基因组学

可以揭示先前隐藏在微环境中的物种多样性，是理解整个生命世界的一次

改革，使人们在观察微生物世界时拥有更为宽广的视野。宏基因组学研究

的测序数据庞大而且复杂，包含代表着10,000个物种的DNA片段。从如此

庞大复杂的数据中收集、提取有用的生物学信息无疑向研究者提出了很大

的挑战。

2

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究中文摘要

因此，本课题首次利用宏基因组学的方法分析了乙肝肝硬化患者的肠道

菌群结构变化及功能代谢变化。选取16例乙肝肝硬化患者作为病例组，20

例健康人作为对照组，分别来自于中国人民解放军302医院消化科的病人和

病人的家属。研究对象均为40-60岁，身体质量指数在18.5-24.9kgm-2

之间，无明显的饮食偏好。病例组要求患者血清HBVDNA阳性，肝组织

学上存在弥漫性纤维化及假小叶形成，临床诊断为乙肝后肝硬化，无并发

症，无结肠炎等胃肠道疾病，无其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和

正常人在留取肠道粪便样品的前一周未服用抗生素、类固醇等激素、中草药

制剂（包括口服，肌肉注射或静脉注射），未服用微生态制剂或酸奶等益生

菌。提取病例组和对照组的肠道微生物宏基因组DNA,进行高通量Solexa

测序，并对测序结果进行生物信息学分析，包括稀释分析，主成分分析，

显著差异基因的物种注释，eggNOG功能注释，KEGG代谢通路的注释及分

析等。

研究结果发现，与正常人相比，乙肝肝硬化患者肠道菌群结构发生改变，

主要表现为拟杆菌属显著减少（尸＜0.05）,韦荣氏球菌属和肠杆菌科显著增加

（尸＜0.05）,另外，乙肝肝硬化患者肠道微生物的功能代谢发生改变，与氨基

酸的转运和代谢、无机离子的转运和代谢、次级代谢产物的转运和代谢、能

量及异生物质的代谢等功能相关的基因相对丰度显著增加（尸＜0.01）,而与细

胞壁/膜的生物起源、信号转导机制、复制、重组和修复等功能相关的基因相

对丰度显著减少（P＜0.05）,胆汁酸代谢分析发现，肝硬化患者肠道微生物中

次级胆汁酸代谢通路相关的基因相对丰度显著减少（尸=0.013）。

初级胆汁酸在肝脏中合成，随胆汁进入肠道，在胆酸盐水解酶的解离和

脱羟基作用下分解为次级胆汁酸。拟杆菌属产生胆酸盐水解酶，而胆酸盐水

解酶介导的解离和脱羟基作用为拟杆菌属提供碳源、氮源和能量来源，二者

相互依存，一方减少，另一方也随之削弱。

肠道中的胆盐达到一定浓度后会聚合成极性微胶粒，肠道中的脂肪酸、

甘油一酯等代谢产物与微胶粒结合被运载到肠粘膜表面而被吸收。韦荣氏球

菌属会水解聚合的胆盐，阻碍微胶粒形成。乙肝肝硬化患者肠道中韦荣氏球

菌属显著增加，因此微胶粒合成受阻，胆汁滞留，胆道部分阻塞，从而加重

肝硬化。

有研究表明，韦荣氏球菌属和肠杆菌科通常在人体空肠分离物中检测到，

而它们在肝硬化患者结肠中的显著增加，可能是细菌易位的结果。韦荣氏球

菌属和肠杆菌科均为革兰氏阴性细菌，可以产生内毒素。在正常人当中，由

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究中文摘要

于肝脏Kupffer细胞的清除功能，内毒素在血液中的含量极其微弱，小于

0.1EU/mL不会形成内毒素血症影响到正常人的身体健康。而肝硬化患者肝脏

清除功能降低，门-体侧枝循环形成，门脉高压导致肠壁水肿和通透性增加，

在这些因素的共同作用下，内毒素入血增加。一方面，内毒素会诱导一些细

胞因子（如TNF,IL-1和IL-6）的分泌，这些细胞因子会引起细胞外基质的

合成和降解异常，从而促进肝纤维化的进程。另一方面，肠道中韦荣氏球菌

属和肠杆菌科过度繁殖，产生的过量内毒素会抑制肠上皮细胞的蛋白质合成,

因此肠壁屏障受损，进一步威胁到肠道微环境，导致肠道菌群失调。另外，

内毒素抑制肠上皮细胞蛋白质的合成，从而改变肠壁上的载体锚定点，导致

氨基酸和碳水化合物等物质在运输过程中出现异常或缺陷。

乙肝肝硬化患者肠道微生物富集物质转运和代谢功能相关的基因，而缺

失细菌周期相关的基因。由此推测，由于门脉高压，肝功能障碍，宿主抵抗

力降低等因素共同作用，肠道微环境发生改变，对肠道菌群的生长造成了一

个逆环境，在这种压力条件下，促进了一些肠道菌群对物质转运和代谢的作

用加强，形成更为广泛的代谢途径。

本课题首次从一个综合的角度和宽广的视野向人们展现了肝硬化患者肠

道微环境的变化，并发现肝硬化与肠道菌群失调之间存在多个恶性循环，肝

硬化患者的微生态治疗对于疾病的预后至关重要。

关键词：宏基因组学；拟杆菌属；韦荣氏球菌属；乙肝肝硬化；胆酸盐水解

酶

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究英文摘要

HumanGutMicrobiomeAssociatedwithHepatitisBLiver

Cirrhosis

Abstract

Asasuperorganism,human9sphysicalhealthisaffectednotonlybyexternal

environmentandautologousgenes,butalsobyalienmicrobial.Microbiome

sojournwithhuman,regardedasavirtualorgan,carriesoutvariousmetabolic

functions.Mostbacteriaaredwellsinthegut,andthegutmicrobiomeishoumed

ashuman'ssecondgenome.

ThecolonpHofnormalindividualsis6.5〜7.5,andtheintestinal

microbiomecompositiontendstoapproximate,asshownbyBacteroidesspp.

accountingfor50%,whereasEnterobacterandEnterococcusspp.lessthan1%.As

acrediblebacteriabarrier,theobligateanaerobesplayanimportantrolein

maintainingtheintestinalmicrobiomecompositionbalance.Ontheonehand,the

intestinalobligateanaerobestightlyadheretotheenterocytetopreventpotential

pathogenicbacteriaintegratingwithenterocyte;ontheotherhand,intestinal

obligateanaerobesinhibitpotentialpathogenicbacteriaadheringtoenterocyte

throughstrivingfornutrimentfollowedbyproducingacidmetaboliteandreducing

intestinalpH.

AsreportedbyWorldHealthOrganism,about600,000peoplediedrelatedto

chronicHBVinfectioneveryyearintheworld.By2010,Chinahas120million

peoplewereinfectedwithHBV.Aferinvadeintoliver,HBVcanreproduceinthe

livercellsandfurtherinduceadaptiveimmuneresponse,whichwillproducetwo

effects:killinglivercellsandclearingHBV,leadingtolivercirrhosisoverseveral

years.ChinahasahighserumHBVDNApositiverateof76.7%amongpatients

withlivercirrhosis.

Themainclinicalsyndromesofcirrhosisareportalhypertension,liver

functionimpairmentandresisitancereductioninhuman.Portalhypertensionwill

leadtogastrointestinalstasis,edema,stomachandintestineslowdown,intestinal

permeabilityincrease,thentheintestinalpHchangesandintestinalmicrobes

crypticforms.Theimpairedliverfunctionisacrucialreasonofthereduced

secretionofbileandbileacids,aswellasthedecreasedabilityforliver

detoxification.Takentogether,alltheseconfoundingfactorsareresponsibleforthe

changesinintestinalmicro-environmentandmicrobialcommunityimbalance.

Microbesinthehumangutundergoselectivepressurefromlivercirrhosis,yetits

specificcircumstancesandmolecularmechanismsintheintestinalmicrobial

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究英文摘要

communityremainobscure,highlightingtheimportanceofametagenomic

analysistounderstandmicrobialcommunitiesundertheinfluenceofliver

cirrhosis.

Metagenomicsisastudyofthemetagenome,extracteddirectlyfrom

environmentalsamples,processedwithhigh-throughputsequencingand

bioinformationanalysis.BothTraditionalmicrobiologyandmicrobegenomicsare

basedonmicrobecloningproductsandvariousmicrobialdiversitiesaremissed

duetotheculturedlimitations.Atpresent,morethan99%bacteriacan'tbe

culturedanddetectedinlab.Becauseofitsabilitytodisclosurethespecies

diversityhiddeninmicro-environmentpreviously,metagenomics,asarevolution

forunderstandingthewholelivingworld,provideawiderviewforustoobserve

microbialworld.Collectingandextractingvaluableinformationfromenormous

andcomplicateddataundoubtedlyrepresentasignificantchallengeforresearchers.

Herewepresentthefirstmetagenomicresearchontheintestinalbacterial

communitiesfrompatientswithhepatitisBlivercirrhosis.Thirty-sixfaecal

samples(sixteenpatientswithhepatitisBcirrhosisandtwentynormalindividuals,

respectivelyfromGastroenterologydeptof302HospitalofPLAandthepatients9

familymembers),40~60yearsold,withabodymassindex(BMI)=18.5~24.9

kgm-2,andwithoutfoodpreferences,wereselectedforthisstudy.Patientshad

positiveserumHBVDNA,liverdiffusefibrosisandfalselobulesformationfound

byhistologyandnocomplications,othergastrointestinaldiseasesormetabolic

diseases.TheChild-Pughscoringsystemwasusedtoassesstheprognosisof

cirrhosis.Allhealthysubjectshadnormalliverbiochemistrytestswithoutevidence

ofhepaticorotherdiseases.Noneofthesubjectshadreceivedantibiotics,

probiotics,steroidsorotherhormones(includingoral,intramuscularorintravenous

injection)fbratleastoneweekbeforesampling.Patientsandnormalindividuals

wereeachaskedtoprovideafrozenfreshstoolsample,andmicrobiota

metagenomeswereextractedimmediately.Metagenomesweresubjectedto

high-throughputSolexasequencingandbioinformationanalysis,including

rarefactionanalysis,principalcomponentanalysis,speciesannotation,eggNOG

functionannotation,KEGGpathwayannotationofsignificantgenes,andsoon.

OurstudysuggestedthatthefaecalmicrobiotaofpatientswithhepatitisB

cirrhosiscontainsamarkedabsenceofBacteroides(P<0.05)andenrichmentof

Veillonella(P<0.05)andEnterohacteriaceae(P<0.05).Functionaland

metabolicanalysisshoewedthatpatientswithcirrhosishadasignificant

enrichmentofgenesannotatedtoaminoacidtransportandmetabolism,

inorganicionstransportandmetabolism,secondarymetabolitetransportand

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究英文摘要

metabolism,energymetabolism,xenobioticmetabolism(P<0,01),aswellasa

significantabsenceofgenesannotatedtocellwall/membranebiogenesis,signal

transductionmechanism,reproduction,recombinationandrepair(P<0.05).Bile

acidmetabolismanalysisshowedthatpatientswithlivercirrhosishadasignificant

absenceofBSHs(P=0.013).

Primarybileacid,producedinliver,flowedintointestinewithbile,andbroke

downtosecondarybileacidintheroleofBSH.BacteroidesproduceBSH,and

BSH-mediateddissociationroleprovidescarbon,nitrogen,sulfursourceandenergy

forBacteroides.Soonreduces,theotheroneweakens.

Sodiumcholate,duetoitsmolecularstructurecharacteristics,canaggregate

toformmicelleswhenreachesacertainconcentrationandVeillonellaspp.can

hydrolyzeconjugatedbilesaltsandpromotethebilestranded,whichwillleadto

bileductobstructionandaggravatelivercirrhosis.

Thedisorderedintestinalmicrobialcommunitystructureinpatientsimplied

thedecreasedintestinalwallresistanceandchangedintestinalmicro-environment,

whichisconducivetobacteriagrowthduetothereducedsecretionofantibodies

(suchasIgA),lysozyme,andmucusanddestructedacid-basebalanceunderthe

influenceoflivercirrhosis.Additionally,thereducedintestinalbloodperfusion,

mesentericischemiaanddecreasedbowelmovementscausedbylivercirrhosis

giverisetoasignificantincreaseofopportunisticpathogenssuchasgram-negative

aerobicandfacultativeanaerobicEnterobacteriaceaeandanaerobicbacilli

Veillonella.ThesignificantenrichmentofVeillonellaandEnterobacteriaceae.

whichusuallyisolatedfromjejunaseparatorofhealthyadults,incolonfrom

patientswithlivercirrhosismightbetheresultofbacteriatranslocation.

Lipopolysaccharide(LPS),partoftheoutermembraneofgram-negative

bacteriaVeillonellaandEnterobacteriaceae.istheprototypicalformofendotoxin

anditsabilitytocausediseasehasbeenconfirmed.Gram-negativebacteriarelease

endotoxinduringactivecellgrowth,autolysis,orexternallysismediatedby

complementandlysozyme,andphagocyticdigestionofbacterialcells.Immune

dysfunction,inhibitedKupffercellsfunctionandtheformationofcollateral

circulationcausedbylivercirrhosisarehighlyresponsiblefbrthedecreasedability

ofendotoxinclearance,andhighconcentrationsofintestinalendotoxinenterinto

systemiccirculation.LPSbindstothelipid-bindingprotein(LBP)inhumanserum,

andtriggersincreasedsecretionofsomepro-inflammatorycytokines(suchasTNF,

IL-1andIL-6),contributingtothepathophysiologyofliverfibrosisandcirrhosis.

Also,excessendotoxinwillinhibittheintestinalepithelialsynthesis,sothe

intestinalcellbarrierisdamaged,whichwillfurthermaketheintestinalmicrobes

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究英文摘要

imbalanced.Theinhibitionofintestinalepithelialsynthesiscausedbyexcess

endotoxinwillalsomakethecarrieranchorpointchanged,leadingtothedefection

ofaminoacidandcarbohydratetransportion.

PatientswithhepatitisBlivercirrhosishadasignificantenrichmentofgenes

annotatedtothefunctionoftransportandmetabolism,andabsenceofgenes

annotatedtocellcircle.Intestinalmicrohabitatofpatientschangedunderthe

influenceofportalhypertension,arrestedliverfunctionandhostresistance

declining,creatinganinverseenvironmenttotheintestinalmicrobiota

development,andpromotingtheformationofmoreextensivemetabolicpathway.

Herewepresentthefirstmetagenomicresearchontheintestinalbacterial

communitiesfrompatientswithhepatitisBlivercirrhosis.Indeed,intestinal

microbiomeactsasavirtualsysteminhumanandregulatesthebody'smetabolic

balancebygeneadjustmentandmicrobesrestructuring,whichareimportantinthe

diseaseprognosis,andthisiscurrentlyunderinvestigation.

Keywords：Metagenomics;Bacteroides\Veillonella;hepatitisBlivercirrhosis;

bilesalthydrolases

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究前言

_2_£__

月II三

人体的生理健康状态受到环境与基因的双重影响，而基因不仅仅是指人

自身的基因，还包括机体内大量共生细菌的基因。人体的大部分细菌是寄居

在肠道的，肠道微生物群落与人自身存在着互惠共生的密切关系，并与人体

的健康息息相关比久肠道细菌的基因如此重要，2010年，QinJ凶等人将其

命名为人类的“第二基因组”。当宿主处于健康状态下时，肠道菌群亦处

于平衡状态，而当宿主受到疾病侵袭时，肠道菌群失调、紊乱，通常表现

为一些需氧菌（如肠杆菌、肠球菌和变形杆菌等）及梭状芽胞杆菌的显著

增加，同时，作为有益种群的双歧杆菌、乳杆菌显著减少，而在疾病恢复

期，处于失调、紊乱状态的肠道菌群难以在短时间内恢复平衡，因此造成

病情的拖延、加重，甚至恶化，对宿主健康产生恶劣影响。

HBV感染在亚洲和非洲的部分国家蔓延，约1/3的世界人口在他们生命中

的某个时间点被HBV感染。2004年，全世界约有3.5亿人感染HBV,传播途径

包括垂直传播（母婴传播）和水平传播（咬伤、性接触、滥用药物）。一定

地区内HBV的主要传播途径会影响到慢性HBV感染的流行性。在美国大陆和

西欧等低流行区，低于2%的人群有慢性HBV感染，滥用药物和不安全性行为

是主要传播途径；在东欧、俄罗斯、日本等中流行区，约2%〜7%的人群有慢

性HBV感染，在儿童之间显著蔓延；在中国和东南亚等高流行区，大于8%的

人群有慢性HBV感染，母婴传播是最主要的传播途径，而同样是高流行区的

非洲I，HBV在儿童间的传播极为显著。截止至2010年，中国有1.2亿人感染HBV,

其次是印度和印度尼西亚，分别是4000万和1200万人存在慢性感染。据世界

卫生组织的数据显示，每年约有60万人死于慢性HBV感染。

慢性HBV感染可能没有任何临床症状，也可能表现为慢性肝炎，几年之

后发展为肝硬化。HBV的感染很大程度上也增加了肝癌的发病率。HBV通过

病毒表面抗原的preS区域与宿主细胞相结合（然而HBV的受体目前尚不清楚），

进而通过内吞作用内化，HBV通过在肝细胞内复制从根本上损害肝脏功能，

HBV-preS特异的受体在肝细胞表达，机体的适应性免疫应答，尤其是病毒

特异的细胞毒素T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocytes,CTLs）会杀死HBV感

染相关的大部分肝细胞，并产生抗病毒细胞因子清除HBV感染。经过数年的

病情迁延，正常的肝脏组织被纤维组织、瘢痕组织和再生结节所替代，导致

肝硬化，并且肝脏功能受损。在我国，肝硬化患者血清中HBVDNA阳性率高

达76.7%。肝硬化通常是不可逆的，其严重性与病因无关，而与肝功能障碍相

9

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究前言

关⑷，治疗原则主要集中于阻止病情的进展和并发症的发生。肝硬化的病理学

标志是瘢痕组织替代了正常的肝脏软组织，门脉高压，

阻止血流通过肝脏，导致胃肠道淤血，组织水肿，胃肠蠕动减慢，肠道通透

性增加，同时，肝功能损害导致对内毒素的清除功能下降，胆汁和胆酸分泌

减少⑸，肠道微生物的代谢受到影响，再加上宿主防御能力降低，多种因素共

同作用，导致肠腔内环境发生改变，肠道菌群失调。

以往对于肝硬化引起肠道菌群改变的认识不够完整，并且没有功能及代

谢等方面的分析，而宏基因组学的研究方法可以帮助人们从宏观、整体的角

度了解乙肝后肝硬化患者肠道中菌群结构的改变以及功能代谢方面的变化。

宏基因组学研究是指直接提取环境样品中的宏基因组进行高通量测序和

生物信息学分析。传统微生物学以及微生物基因组学都是以可培养的微生物

克隆产物为基础的，而目前自然界中大于99%的细菌在实验室无法检出，培

养的局限性使人们错过了捕捉众多微生物多样性的机会。而宏基因组学可

以揭示先前隐藏在微环境中的物种多样性，是理解整个生命世界的一次改

革，为人们观察微生物世界提供了更为宽广的视角。首个宏基因组学的高

通量测序是通过巨大并行的454焦磷酸测序法实现的⑹，另外两个用于环境

样品宏基因组学研究的测序技术是第二代IlluminaGA(GenomeAnalyzer)

和AppliedBiosystemsSOLiD系统⑺。454焦磷酸测序法通常产生100〜

200bp的reads,Illumina和SOLiD产生25〜75bp的reads181,其产生DNA

片段的长度显著短于Sanger测序法，后者reads长度约为750bp,然而测序

量的增加则弥补了这一局限性，焦磷酸测序可产生200〜500M的碱基，

Illumina测序平台可产生20-50G碱基。另外，这些测序技术的另外一个优

势是在测序之前无需克隆DNAo

宏基因组学研究的测序数据庞大而且复杂，包含代表着10,000个物种

的DNA片段。牛瘤胃宏基因组学研究测序结果产生279G碱基对，人类肠

道微生物基因目录定义了3.3M的基因，是由567.7G的测序数据组装产生

的。从如此庞大复杂的数据集中收集、提取有用的生物学信息无疑向研究

者提出了很大的挑战。

比较宏基因组学研究使人们可以更加深刻的理解复杂微生物群落的功能

及其对机体健康的作用，可以在序列组成水平进行(比较G+C含量或基因

组大小)，也可以在物种多样性及功能组成水平进行。种群结构和系统发

育多样性的比较可以基于16S,或其它的系统发育标记基因，而对于低多样

性的群体，可以进行宏基因组数据集的基因组重构⑶。宏基因组功能比较可

以通过将

10

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究前言

序列与参考数据集（如COG和KEGG）比对,分析各个类别中基因的相对丰度，

评估显著性差异口叫这种以基因为中心的研究方法重点在于将微生物群落作

为一个整体分析其功能，而不是将物种分类分析。已有文献研究表明，在相

似的环境中，微生物群落的功能组成相似阴。因此，比较宏基因组学研究使人

们有能力认识到不同的栖息环境在微生物群落结构及功能变化中所起的作用。

本研究首次利用宏基因组学的方法，采用高通量Solexa测序以及生物信

息学分析，对乙肝肝硬化患者肠道微生物群落结构及功能代谢的变化进行

了全面分析。长期连续的监测机体肠道菌群结构的组成及变化，可以及早

发现机体的异常改变，实现疾病的早期预测以及对肠道菌群整体结构和功

能的准确精细测定，同时也可以为疾病的肠道微生态治疗提供理论依据。

11

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究前言

参考文献

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12

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

第一部分肠道菌群宏基因组DNA的基因数据产出

乙肝肝硬化主要从以下三个方面影响肠道微环境：（1）门脉高压，静脉

回流受阻，胃肠道淤血，组织水肿，胃肠蠕动减慢，进一步引起肠道通透性

增加，pH值改变；（2）肝功能受损，导致胆汁酸分泌减少、对内毒素的清除

能力下降等，影响肠道菌群的结构和代谢；（3）宿主抵抗力降低。然而，乙

肝肝硬化患者肠道微环境具体发生了怎样的改变，目前还没有一个完整准确

的认识。宏基因组学是帮助人们全面认识肠道微环境的一个很好的方法，它

不要求物种的分离，而是直接提取环境样品中的宏基因组进行高通量测序和

生物信息学分析，使人们从一个整体、宏观的角度认识肠道微环境。

1.1材料与方法

1.1.1实验仪器与试剂

本实验所用到的实验仪器列于表l-lo

表1-1实验仪器与耗材

仪器与耗材出产公司

生物安全柜Thermo公司

高压蒸汽灭菌锅Sanyo公司

台式冷冻离心机Thermo公司

柜式低温离心机6500KuBoTa公司

纯水仪Milli-Q公司

台式恒温振荡器江苏太仓试验设备厂

移液器Eppendorf公司

核酸定量仪ND-1000GENE公司

玻璃珠SIGMA公司

滤器(0.22|im)美国PALL公司

13

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

分析电子天平Sartorins公司

核酸电泳仪北京六一仪器厂

凝胶成像仪Bio-Rad公司平

衡磁力搅拌器常州国华电器有限公司

本实验所用到的实验试剂列于表1-20

表1-2实验试剂

试剂名称出产公司

EDTA国药集团化学试剂有限公司

Tris-HClAMRESCO公司

溶菌酶AMRESCO公司

蛋白酶KAMRESCO公司

NaCl西陇化工股份有限公司

异硫鼠酸胭SIGMA公司

十二烷基肌氨酸钠SIGMA公司

冰醋酸北京北化精细化学品有限公司

异丙醇国药集团化学试剂有限公司

无水乙醇国药集团化学试剂有限公司

RNA酶AMRESCO公司

磷酸国药集团化学试剂有限公司

PVPPSIGMA公司

14

乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

醋酸钾国药集团化学试剂有限公司

1.1.2实验步骤

1.1.2.1研究对象的选取

选取乙肝肝硬化患者作为病例组，选取正常成年人作为对照组，分别来

自于中国人民解放军302医院消化科病人和病人的家属。要求研究对象均

为40~60岁，BMI（BodyMassIndex,身体质量指数）在18.5〜24.9kgm2

之间，无明显的饮食偏好。病例组要求患者血清HBVDNA阳性，肝组织学

上存在弥漫性纤维化及假小叶形成，临床诊断为乙肝后肝硬化，无并发症,

无结肠炎等胃肠道疾病，无其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和正常

人在留取肠道粪便样品的前一周未服用抗生素、类固醇等激素、中草药制剂

（包括口服，肌肉注射或静脉注射），未服用微生态制剂或酸奶等益生菌。肝

硬化Child-Pugh评分标准见表l-3o

表1-3肝硬化的Child-Pugh评分标准

临床生化指标

计分肝性脑病总胆红素白蛋白凝血酶原时间

腹水

（分期）（pmol/L）（g/L）延长（秒）

1分无无<34>35<4

2分1-2轻度34-5028-354-6

3分3-4中重度>50<28>6

肝硬化的Child-Pugh分级标准涉及到五项临床指标，分别为：

（1）肝性脑病分期肝性脑病主要是由于血液中有毒物质堆积，而受损的肝脏

无法清除造成

的。肝性脑病分为四个时期，一期：意识的轻微缺失，欣快或者焦虑，注意

力持续时间缩短；二期：昏睡或者冷漠，时间或空间判断上出现轻微障碍，

人格轻微改变，行为障碍；三期：嗜睡，但对于言语刺激有反应，明显的定

向障碍；四期：昏迷，对言语刺激和有害刺激无反应。

（2）腹水的有无及严重程度一般情况下，正常人腹腔内的液体少于200ml,

超过200ml时即为腹水。

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

轻度腹水为300〜500ml,部分患者没有明显的不适,仅可通过超声或CT判断；

中度为500〜3000ml,患者自觉腹胀，可以通过腹部侧面膨胀和移动性浊音观测到;

重度为3000ml以上，显著可见，患者感到呼吸困难，并伴有下肢肿胀。

（3）总胆红素

血液中的红细胞衰老或被破坏后，血红蛋白中的亚铁血红素在脾脏的网

状内皮细胞转化为间接胆红素（非结合型胆红素），间接胆红素不溶于水，

与白蛋白结合被运输到肝脏。在肝脏葡糖醛酸基转移酶的作用下，间接胆红

素与葡萄糖醛酸结合，转化为可溶于水的直接胆红素（结合型胆红素），直

接胆红素和间接胆红素之和就是总胆红素。

（4）白蛋白含量血清白蛋白由肝脏合成，是最丰富的血浆蛋白，通常占血浆

蛋白的60%。

正常白蛋白参考值范围为35〜50g/L。肝硬化患者肝功能降低，导致白蛋白合

成受阻，血清白蛋白含量降低。

（5）凝血酶原时间

正常的凝血酶原时间为11-13秒。肝硬化患者肝脏功能受损，导致凝血

因子合成受阻，凝血酶原时间延长。

以上五项得分相加计算出肝硬化Child-Pugh分级：A级：5〜6分，一年

存活率为100%,两年存活率为85%；B级：7〜9分，一年存活率为81%,

两年存活率为57%；C级：＞10分（包括10分），一年存活率为45%,两年存活

率为35%。

1.1.2.2肠道菌群宏基因组DNA的提取

乙肝肝硬化患者及正常人留取新鲜的粪便样品，并在收集后2h内送入实

验室，立即提取宏基因组DNA。

肠道微生物宏基因组DNA提取步骤如下：

（1）细胞的裂解与破碎

在50ml离心管内按如下配方配制裂解液体系：

2.5ml异硫氟酸胭裂解液

5ml5%十二烷基肌氨酸钠

0.4ml10%十二烷基肌氨酸钠

0.54mlEDTA

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

切取粪便样品(体积约为两个黄豆粒大小)加入裂解液体系。

振荡5min,粪便样品中加入250口1溶菌酶(100mg/ml),冰上静止5min。振

荡5min,冰上静止5min,重复3次。

37℃水浴Iho

(2)去除蛋白质、细胞碎片和研磨杂质

加入250m蛋白酶K(50mg/ml),37℃水浴lh。

称取1g玻璃珠(425〜600^111)加入样品中。振荡5min,冰上静止5min,重

复一次。

称取150mgPVPP加入样品中，振荡5min,离心(4℃,lOOOOrpm,lOmin),弃

沉淀，在上清中加入2mlTENPC50mMTris-HCLpH8.0,20mMEDTApH8.0,

lOOmMNaCl,1%PVPP),离心(4℃,lOOOOrpm,30min),弃沉淀，在上清中加

入等体积异丙醇(约10ml),混匀，室温静置15min,离心(4℃,lOOOOrpm,

30min),弃上清，在沉淀中加入4.5ml磷酸缓冲液和500ul醋酸钾，使pH值调

至中性。4℃过夜，使宏基因组DNA充分析出。

离心(4℃,14000rpm,30min),弃沉淀，上清中加入45ul醋酸钠和1ml

冰冻无水乙醇，-20℃静置30min,离心弃上清，依次用70%乙醇(500gl)和

无水乙醇(500g1)清洗沉淀。待乙醇充分挥发后用适当纯水溶解DNA。

(3)去除样品中的RNA

加入28RNA酶(10mg/ml),37度水浴30min。宏基因

组DNA样品置于-80C储存。本实验所需试剂配制方法

如下：磷酸盐缓冲液：pH8.0,1M

-9.32mLNa2HPO4：14.2gNa2HPO4力口100mLH2O,混匀

-0.68mLNaH2P04：12gNaH2PO4力口100mLH2O,混匀

-90mLH2O

混匀，室温保存。

EDTA：pH8.0,0.5M

称取7.306gEDTA于100mL烧杯中，再加入40mLMilliQ灭菌水，

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究第一部分

用热磁力搅拌器搅拌至完全溶解，待溶液冷却后，用NaOH调节pH

值至8.0,最后定容至50mL。

Tris-HCL：pH8.0,IM

称取6.05gTris碱于100mL烧杯中，加入40mLMilliQ灭菌水，用

热磁力搅拌器充分搅拌溶解，待溶液冷却后，用NaOH调节pH值至

8.0,最后定容至50mL。

TENP(50mMTris-HCLpH8.0,20mMEDTApH8.0,lOOmMNaCL,1%

PVPP)

-20mLH2O

-1.5mLTris-HCLpH8.0,IM

-1.2mLEDTApH8.0,0.5M

-0.6mLNaCL5M

-0.3gPVPP

定容至30mL,使用0.22gm滤器过滤。

4M异硫氟酸弧

-12.37g异硫氟酸胭(注意有毒)

-13.5mLH2O

-2.6mLTris-HCLpH8.0,IM

搅拌至完全溶解，60〜70℃水浴加热10分钟后灭菌处理，4℃避光保

存。

NaCL5M

14.6gNaCL加50mLMiHiQ灭菌水，使用0.22pim滤器过滤。

10%十二烷基肌氨酸钠

2g十二烷基肌氨酸钠加入20mLMilliQ灭菌水，使用0.22pm滤器过

滤。

5%十二烷基肌氨酸钠

称取1g十二烷基肌氨酸钠加入20mL磷酸盐缓冲液(pH8.0,1M),

使用0.22gm滤器过滤。

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乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究