第1章发酵工程课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节传统发酵技术的应用第1章发酵工程一、发酵与传统发酵技术1.发酵（1）概念：

指人们利用_______，在_____的条件下，将原料通过_____________转化为人类所需要的产物的过程微生物适宜微生物的代谢（2）原理：

不同的微生物具有_________________的能力，因此利用它们既可以生产出人们所需要的多种产物产生不同代谢产物（3）类型：需氧发酵厌氧发酵如：醋酸发酵如：酒精发酵乳酸发酵2.传统发酵技术（1）概念：

直接利用原材料中________的微生物，或利用_________保存下来的面团、卤汁等______中的微生物进行发酵、制作食品的技术天然存在前一次发酵发酵物（2）特点:

传统发酵以混合菌种的________及__________为主，通常是_______或_______的；固体发酵半固体发酵家庭式作坊式（3）常见产品:腐乳、酱、酱油、醋、泡菜、豆豉腐乳参与发酵的微生物：酵母曲霉毛霉（主要）发酵原理:经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解为___________________；小分子的肽和氨基酸_____细菌，代谢类型为__________；在_____的情况下能将_______分解成______；二、尝试制作传统发酵食品1.传统发酵食品制作常用微生物（1）乳酸菌①代谢特点：厌氧无氧葡萄糖乳酸异养厌氧型②发酵原理（反应简式）C6H12O6酶2C3H6O3（乳酸）+能量③应用：乳制品的发酵泡菜的腌制④分布：空气土壤植物体表人或动物的肠道内⑤常见类型：乳酸链球菌乳酸杆菌（2）酵母菌①代谢特点：是一类单细胞____，是__________微生物；在_____的条件下能进行________真菌无氧酒精发酵兼性厌氧②发酵原理（反应简式）C6H12O6酶2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量③重要影响因素：温度酿酒酵母的最适生长温度约为_____；____是影响酵母菌生长的重要因素；28℃④应用：酿酒制作馒头和面包⑤分布：能以多种糖类作为营养物质和能量来源，在一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常发现酵母菌的存在。（3）醋酸菌①代谢特点：___氧细菌，代谢类型是____________；当______________时，能将___分解为____；当________时则将_____转化为_____，再将_____变为____；多数醋酸菌的最适生长温度为________；好O2、糖源都充足乙醛异养需氧型糖醋酸缺少糖源乙醇乙醛醋酸30-35℃②发酵原理（反应简式）C6H12O6+2O2酶2CH3COOH（醋酸）+2H2O+2CO2+能量C2H5OH+O2酶CH3COOH（醋酸）+H2O+能量③生产应用醋酸菌可用于制作各种风味的____醋①利用_______________________来进行发酵；2.制作泡菜（1）发酵原理：植物体表面天然的乳酸菌②发酵期间，乳酸会________，当它的质量百分比为_________时，泡菜的口味、品质最佳；不断积累0.4%-0.8%③相关反应式C6H12O6酶2C3H6O3（乳酸）+能量（2）发酵条件适宜的_____；根据室内温度控制_________严格控制_____条件；温度厌氧发酵时间（3）制作流程配制盐水用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用；原料处理、蔬菜装坛将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满；加盐水将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过菜料，盖好坛盖封坛发酵向坛盖边缘的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水；根据室内温度控制发酵时间；（4）结果分析与评价①盐的作用：调味，抑制其他微生物生长②盐水浓度要适宜的目的：过高，乳酸发酵将受抑制；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质③盐水煮沸的目的：杀菌，去除水中的溶解氧④盐水冷却后使用的目的：为了不影响乳酸菌的生命活动⑤泡菜坛子使用之前要检查密封性的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件⑥用水密封泡菜坛的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件⑦以上说明泡菜制作需要什么条件？说明泡菜制作需要在无氧条件下进行（即厌氧条件）⑧泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌⑨为什么泡菜坛只能装八分满？

在泡菜发酵初期，由蔬菜表面带入的大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，它们可进行发酵，发酵产物中有较多的CO2，如果泡菜坛装得太满，发酵液可能会溢出坛外；另外，泡菜坛装得太满，会使盐水不太容易完全淹没菜料，从而导致坛内菜料变质腐烂；

（防止由于产生CO2而导致发酵液溢出坛外；防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂）（5）进一步探究

泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生；

膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡；

查阅资料，设计实验跟踪检测泡菜在制作过程中亚硝酸盐含量的变化，并探索腌制方法、时间长短和温度高低等条件对亚硝酸盐含量的影响，寻求提高泡菜质量的措施。

某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加人一些“陈泡菜水”；在用质量百分比为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。请你帮他分析相关问题1.泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？

腌制方法、腌制时间长短、温度高低2.据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适?为什么?应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平；3.加入“陈泡菜水”的目的是什么？“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。（6）腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化发酵时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵前期发酵中期发酵后期变化曲线少（O2抑制乳酸菌活动）少增加（硝酸盐还原菌的作用）最多（乳酸积累，抑制其他菌活动）增多达到最多后开始下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解）减少（乳酸积累，pH下降，抑制乳酸菌活动）继续增多，最后保持稳定下降至保持相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）3、制作果酒和果醋（1）发酵原理：①许多新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的___________；野生酵母菌②在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒（通过有氧呼吸大量繁殖，通过无氧呼吸产酒精）③在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。④相关反应式C6H12O6+6O2+6H2O酶6CO2+12H20+能量C6H12O6酶2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量C6H12O6+2O2酶2CH3COOH（醋酸）+2H2O+2CO2+能量C2H5OH+O2酶CH3COOH（醋酸）+H2O+能量果酒果醋（2）发酵条件①制作果酒时将温度控制在_________进行发酵；18～30℃②制作果醋时将温度控制在__________进行发酵。30～35℃温度：氧气：①制作果酒时，酵母菌在_________的情况下大量繁殖；在_________下，进行酒精发酵；②在____的条件下，果酒经醋酸菌的作用可以进一步发酵成果醋。氧气充足无氧条件有氧（3）制作流程器具消毒将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用冲洗葡萄取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干榨汁装瓶用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖酒精发酵将温度控制在18～30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12d。果酒检测可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测打开瓶盖，盖上纱布果醋检测当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30～35℃，时间为7～8d。（4）实验分析与思考①冲洗的目的：去除表面灰尘、污物②冲洗1-2次即可，能否连续冲洗，为什么？不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少③为什么去梗前冲洗：避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会④葡萄汁装入发酵瓶时，为何要留有1/3的空间？a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出⑤每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：排出气体⑥拧松但不打开的目的：防止杂菌污染果酒果醋（5）果酒发酵与果醋发酵的装置结构作用酒精发酵时状态醋酸发酵时状态充气口排气口出料口长而弯曲的胶管通入空气关闭打开，并接入气泵排出CO2打开打开便于取样监测关闭关闭方指控其中微生物的污染（6）果酒发酵与果醋发酵的比较果酒发酵果醋发酵发酵菌种菌种来源菌种代谢类型菌种生物类型发酵原理发酵条件温度时间氧气酵母菌醋酸菌附着在新鲜水果果皮表面的野生酵母菌空气中的醋酸菌或人工接种的醋酸菌异养兼性厌氧型异养需氧型真核生物原核生物18～30℃30～35℃10～12d7～8d前期需氧，后期不需氧始终需氧（7）结果分析与评价

①在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？

在葡萄酒的制作过程中，发酵液会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生CO2；开始发酵后，CO2产生越来越多，会使发酵液出现“沸腾”现象在发酵的10天后，这种现象最明显。

如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色。

果醋发酵过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液的液面上会出现一层菌膜，这是醋酸菌膜。②在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？果酒中除了酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等微生物。

乳酸菌可能分解果酒中的糖、甘油、酒石酸等，从而使果酒变质。可以通过调节发酵的温度、果酒的pH等来控制乳酸菌的含量。

在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸；在缺少糖源的情况下，乙醇便是醋酸菌的碳源和能源，它将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢活动，因此在制作果酒的过程中尽量减少O2含量，可以抑制醋酸菌的生长繁殖。此外，通过调节发酵的温度、果酒的pH等同样可以控制醋酸菌的含量。

③在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？醋酸菌从何而来？采用什么措施可以加快果醋的制作？

随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低。

在我们的实验条件下，当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。

在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌。我们制作果醋时，可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋酸菌)，用这层薄膜进行接种可以明显缩短制作果醋的时间。第2节微生物的培养技术及应用一微生物的基本培养技术一、微生物概述1.微生物的概念：_________________________的统称。包括_______________________________等

2._____________，_______________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物3.实验室培养微生物的条件：①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件；②要确保__________________，并将需要的微生物分离出来。营养和环境其他微生物无法混入难以用肉眼观察的微小生物细菌、真菌、病毒及一些原生生物

人们按照__________________________，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。二、培养基的配制1.培养基的概念、作用及类型（1）概念：微生物对营养物质的不同需求（2）作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。（3）类型：液体培养基固体培养基菌落不含凝固剂（如琼脂）在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一呈液态状态微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长形成肉眼可见的菌落补充资料：培养基的类型及用途划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物天然培养基合成培养基固体培养基液体培养基半固体培养基选择培养基鉴别培养基2、培养基的营养构成:（1）基本成分：水、碳源、氮源、无机盐。碳源无机碳源：有机碳源：氮源NH4＋、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。无机氮源：有机氮源：来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质无机盐Zn、Cu、Mn、Co、Mo等大量元素：微量元素：Ca、K、Mg等牛肉膏、蛋白胨：自养微生物异养微生物为什么培养基需要氮源？

是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。（2）特殊需求：满足微生物对

______________________的需求④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；③培养细菌时，需要将培养基调至_____________；维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水例：某种细菌培养基的营养构成pH、特殊营养物质、氧气三、无菌技术1.概念：_____________的培养微生物的操作技术2.手段：主要包括____和____。（1）对实验操作的____、操作者的________，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的____、________和______等进行灭菌。

无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者被微生物感染。防止杂菌污染消毒灭菌空间衣着和手器皿接种用具培养基3.消毒（1）概念：

指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（2）常用的消毒方法①煮沸消毒法：

100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃处理30s～1min适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。③化学药剂消毒法:④紫外线消毒法：

接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。4.灭菌（1）概念：

指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（2）常用的灭菌方法①湿热灭菌：

利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌效果最好，100kPa、121℃下维持15～30min，工具为高压蒸汽灭菌锅，常用于培养基、无菌水等的灭菌。②干热灭菌：

将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160～170℃的热空气中维持2～3h。常用于耐高温的和需要保持干燥的物品（如玻璃器皿、金属用具等）。③灼烧灭菌：

直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧，可以迅速彻底地灭菌。适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位四、微生物的纯培养1.概念：（1）培养物：

在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。（2）纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体（5）纯培养：获得纯培养物的过程（3）菌落：

分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。

将单个微生物分散在固体培养基上的方法2.原理：微生物群分散或稀释单个细胞单个菌落繁殖（4）平板划线法和稀释涂布平板法：3.步骤：

微生物的纯培养包括___________、____、____、分离和____等步骤配制培养基灭菌接种培养（以酵母菌的纯培养为例）（1）制备培养基：①配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。②灭菌：

将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。培养基灭菌：

将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。培养皿灭菌：③倒平板待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。①拔出锥形瓶的棉塞②将瓶口迅速通过火焰③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖倒平板的具体操作步骤④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。（2）接种和分离酵母菌

通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作(平板划线法)，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞③试管口通过火焰④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线平板划线法的具体划法注意：①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次；②划线首尾不能相接；③每次划线前接种环进行灭菌；④划线后,培养皿倒置培养。2025/5/8

为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上原有微生物杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者2025/5/8（3）培养酵母菌

完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。4.结果分析与评价（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？

在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。一、选择培养基1.概念：

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基2.原理：

人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH3.举例：（1）利用改变培养条件进行选择培养。70～80℃的高温分离耐高温的水生栖热菌使用将pH调至酸性的培养基分离耐酸菌（2）利用营养条件进行选择培养不加碳源（含碳有机物）的培养基分离出自养型微生物不加氮源的培养基分离出固氮菌（3）利用添加某种化学物质进行选择培养加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌二微生物的选择培养和计数选择培养基配方的设计

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？

在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？

除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同二、微生物的选择培养1.方法：稀释涂布平板法2.操作流程①铲取土样，将样品装入纸袋中②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1049mL无菌水1ⅹ1090mL无菌水1mL1mL1mL1mL1mL1mL③取0.1mL菌液，滴加到（选择）培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。注意事项：①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。

待涂布的菌液被__________后，将平板_____，放入___________中培养____d，在涂布有________菌液的平板上就可以观察到分离的_______；培养基吸收倒置恒温培养箱1-2合适浓度单菌落

稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目；三、微生物的数量测定——间接计数法1.稀释涂布平板法（1）原理：

当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____；高菌落样品稀释液活菌菌落活菌（2）计数原则①选择菌落数为_______的平板计数30-300②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______；3平均值样品的______将直接影响平板上的菌落数目；稀释度（3）结果分析：①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；原因：________________________________________________________②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；少当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落菌落数（4）计算公式：每g样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数2.显微镜直接计数——直接计数法（1）方法：

利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；细菌计数板血细胞计数板显微镜一定体积血细胞计数板常用于_______________________________等的计数相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子细菌计数板可对_________________进行观察和计数；细菌等较小的细胞（2）优点：快速直观（3）缺点：①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。②个体小的细菌在显微镜下难以观察。四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.提出问题（实验目的）（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。2.实验原理

绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。组分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO23.实验步骤（1）土壤取样①取样地点要求：

酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。②取样过程：

铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。③注意事项：

取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。（2）制备培养基①选择培养基：以尿素为唯一氮源葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用（3）样品的稀释与涂布平板（稀释涂布平板法）

测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养

在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）②如何验证培养基中是否含有杂菌？设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基注意事项：

本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。（4）微生物的培养与观察①培养条件：

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）②观察：

每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）（5）结果分析现象分析未涂布培养基上无菌落生长未涂布培养基上有菌落生长牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目培养基未被杂菌污染培养基被杂菌污染选择培养基具有选择作用2025/5/8①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近?③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，可能是什么原因引起的?

如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。

如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。

如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。（5）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定①原理：

细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。②方法：

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：液体培养基：可以直接看液体的变色情况；固体培养基：平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的2025/5/8两种纯培养方法的比较第3节发酵工程及其应用第1章发酵工程一、发酵工程的基本环节1.选育菌种（1）目的：获得_______________________性状优良的菌种（2）菌种来源：从自然界中筛选、________或____________________。诱变育种基因工程育种（3）实例：筛选产酸量高的黑曲霉用来生产柠檬酸；使用基因工程改造的啤酒酵母，加速发酵、缩短生产周期；

某镇特产一种美酒，以下是对该镇环境的描述：四面环山，地势低洼，气候炎热，具有独特的微生物种群，因为与外界的空气对流循环较缓慢，所以微生物种群较稳定。这对你理解发酵工程中菌种选育的重要性有什么启示？

优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败2.扩大培养（1）目的：获得___________更多的菌种（2）原因：

工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。3.配制培养基：①在菌种确定之后，要_________制备培养基。②在生产实践中，培养基的配方要经过________才能确定。4.灭菌：选择原料反复试验（1）灭菌原因：

发酵工程种所用的菌种大多是________，一旦有杂菌污染，可能导致_____________。单一菌种产量大大降低（2）________________都必须经过严格的灭菌；培养基和发酵设备5.接种：将__________的菌种投放到______中发酵罐扩大培养后6.发酵罐内发酵—发酵工程的中心环节（1）要求：①发酵过程中，要________培养液中___________、________等，以____________；②要及时添加_______________，要严格控制_____、____和______等发酵条件；随时检测微生物数量产物浓度了解发酵进程必需的营养物质温度pH溶氧量（2）严格控制发酵条件的原因：①环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成；②严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态（3）不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵①在_____和______条件下会积累谷氨酸；②在_____条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺；中性弱碱性酸性电动机排气管pH计冷却水排出口冷却夹层发酵液搅拌叶轮生物传感器装置空气入口放料管阀门培养物或营养物质的加入口观察孔取样管温度传感器和控制装置冷却水进入口（4）现代发酵工程使用的发酵罐的优点

均有_______________，能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行_____和_____，还可以进行_________，使发酵全过程处于________；计算机控制系统监测控制反馈控制最佳状态7.分离、提纯产物方法：①发酵产品是微生物细胞本身时，可在发酵结束之后，采用_____、_____等方法将菌体_____和_____；②发酵产品是代谢物时，可______________采取____的_____、_____和_____措施来获得产品；过滤沉淀分离干燥根据产物的性质适当提取分离纯化8.获得产品：单细胞蛋白味精1.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时，需要考虑哪些因素？①在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；②生产所需代谢物的产量高；③发酵条件易控制；④菌种不易变异，退化等。2.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？①反复试验确定培养基的配方；②对培养基和发酵设备进行严格的灭菌；③随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等；④及时添加必需的营养组分；⑤严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反馈控制3.在进行发酵生产时,排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么？

不能；因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气