第一章 色谱基础理论课件

第一章

色谱基础理论概述色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异，通过多次重复使微小的差别积累起来变成大的差异，从而使混合物中各组分达到分离。色谱技术在近三十多年中的飞速发展已形成一门专门的科学，称为色谱学。广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分离分析方法。2025/5/261第一章色谱基础理论色谱法的分类

按流动相与固定相的分子聚集状态分类气相色谱法（气-固，气-液）液相色谱法（液-固，液-液）超临界流体色谱（SFC）按操作形式分类柱色谱，平面色谱，逆流分配2025/5/262第一章色谱基础理论按色谱过程的分离机制分类

吸附色谱（adsorption~）利用吸附能力的差别；分配色谱（partition~）利用分配系数的差别；空间（分子）排阻色谱（stericexclusion~）或称凝胶色谱法（gel~）利用被测物分子大小不同而导致的渗透系数差异。2025/5/263第一章色谱基础理论离子交换色谱（ionexchange~）利用在离子交换树脂上的交换能力差别。又可分为:氨基酸分析（aminoacidanalysis）离子色谱法（ionchromatography）亲合色谱（affinity~）将生物活性配位基（酶、辅酶，抗体等）键合到载体表面形成固定相，利用亲合力大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品）。2025/5/264第一章色谱基础理论毛细管电色谱（capillaryelectro-~）依靠色谱与电场两种作用力，利用分配系数和电泳速度差别而分离。毛细管电泳（capillaryelectrophoresis）以高压电场为驱动力，根据样品组分的淌度和分配系数而分离。手性色谱（chiralchromatography）利用手性识别原理，用于手性药物的分离分析。2025/5/265第一章色谱基础理论填充柱毛细管柱毛细管电色谱毛细管电泳柱色谱平面色谱逆流分配色谱GC

LCSFCCEC色谱法经典液相色谱HPLC纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法2025/5/266第一章色谱基础理论色谱法特点具有分离、分析功能，可排除组分间的相互干扰，将组分逐个进行定性、定量。发展快，应用广。色谱法在药物分析中应用主要用于成分复杂的样品，如：制剂分析、中成药、天然药物提取分离、合成化合物纯度、有关杂质分析、残留有机溶剂分析、残留农药分析、药代动力学、生物利用度，治疗药浓监测、生物制品药物分析、临床诊断、法医鉴定等。2025/5/267第一章色谱基础理论色谱法发展向自动化、联用型、人工智能化方向发展：色谱-光谱联用气相色谱-付里叶变换红外光谱高效液相-紫外吸收光谱气相色谱-质谱（GC-MS）高效液相-质谱（HPLC-MS）高效液相-付里叶变换红外光谱超临界流体色谱-质谱薄层色谱-紫外吸收光谱毛细管电泳-质谱2025/5/268第一章色谱基础理论色谱-色谱联用指二种色谱方法的联用，也称二维色谱法。目的是用一种色谱法补充另一种色谱法分离效果上的不足。常见的有：气相色谱-气相色谱高效液相-气相色谱高效液相-高效液相高效液相-薄层色谱二维薄层色谱色谱-色谱联用法可提高分离效果，获取更多的定性分析信息。2025/5/269第一章色谱基础理论血浆中卡维地洛尔非手性/手性色谱分离实验装置第1阀（0～4.2min,实线位置；4.2～18min,虚线位置）；第2阀（0～3.7min,实线位置；3.7～18min,虚线位置）。废液例2025/5/2610第一章色谱基础理论2025/5/2611第一章色谱基础理论热力学理论——塔片理论是由平衡的观点来研究分离过程，是一种半经验理论，以塔片理论为代表。动力学理论——速率理论是从动力学观点，即速度来研究各种动力学因素对柱效的影响，以VanDeemeter方程式为代表。色谱理论2025/5/2612第一章色谱基础理论基本概念色谱峰（peak）——样品产生的电信号强度对洗脱时间作图。称为流出曲线，浓度-时间曲线，也称色谱带（band）。色谱峰有三种形式：对称峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）t(min)C2025/5/2613第一章色谱基础理论峰形参数：对称因子（symmetryfactor，fs）

fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）来衡量

T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)2025/5/2614第一章色谱基础理论T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的对称性hABd1xW0.05h2025/5/2615第一章色谱基础理论例1测得某一物质的色谱峰高为2.55cm,

则其0.05h=0.6275cm,量取：W0.05h=0.575cm，量取：A=0.285cm计算T或fs，根据T=W0.05h/2d1fs=(A+B)/2AhABd1xW0.05hT=0.575cm/（2×0.285）cm=1.009x=0.05h2025/5/2616第一章色谱基础理论一个色谱峰，可用三项参数来描述：峰高或峰面积——定量峰位（保留值）——定性峰宽——

衡量柱效峰面积(A)峰高(h)tRtR2025/5/2617第一章色谱基础理论基线（baseline）——在操作条件下，检测器中只有流动相通过时的流出曲线称为基线。它反映了仪器的噪音随时间的变化。噪音（noise，N）——各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来描述。Nmv基线漂移2025/5/2618第一章色谱基础理论定性参数保留值保留时间，保留体积相对保留值保留指数2025/5/2619第一章色谱基础理论保留值保留时间（retentiontime，tR）——进样开始到组分色谱峰顶点时间间隔。死时间（deadtime，t0或tM）——流动相通过色谱系统的时间。t0或tM的测定：GC——用空气峰（热导检测）或甲烷峰（FID）测定HPLC——溶剂峰前沿出现的时间，或用不被固定相吸附或溶解的组分，如NaNO3（210nm测定）的保留时间。2025/5/2620第一章色谱基础理论调整保留时间（adjustedretentiontime，t

R）也称为校正保留时间——某组分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间，即：t

R=tR

－t0，在实验条件一定（温度、固定相），t

R决定组分的性质，故t

R是定性的基本参数。2025/5/2621第一章色谱基础理论t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime进样2025/5/2622第一章色谱基础理论

保留体积（retentionvolume，VR），又称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱柱，由进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时，通过色谱柱的流动相体积。对于对称峰，VR为样品组分被流动相带出色谱柱1/2量时所需流动相体积：

VR=tR

·FcFc为流速（ml/min），Fc一定时，VR与tR成正比。Fc大时tR就短，VR与流速无关。2025/5/2623第一章色谱基础理论相对保留值（

1,2)

——指组分（1）与参照物（2）两者调整保留值的比值。

1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K为分配系数）保留指数（I，Kovats指数）

——是把组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述。2025/5/2624第一章色谱基础理论以正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值的标准物。方法如下：用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来标定待测物的保留指数（Ix）

Ix=100[Z＋n]z与z+n代表含有z与z+n个碳原子的正构烷烃，n可为1、2，通常n=1。lgt’R(x)－lgt’R(z)

lgt’R(z+n)－lgt’R(z)2025/5/2625第一章色谱基础理论例：乙酸正丁酯I值的测定，在一定色谱条件下（固定相，柱温），用正庚烷及正辛烷标定。t0n-c7n-c8乙酸正丁酯2025/5/2626第一章色谱基础理论n-C7：t’R=174

n-C8：t’R=373.4

乙酸正丁酯：t’R=310

z=7，z+n=8，n=1Ix=100[7＋1]=775.6说明乙酸正丁酯在该色谱条件下的保留行为相当于含有7.756个碳的正构烷烃的保留行为。lg373.4

－lg174

lg310－lg174

2025/5/2627第一章色谱基础理论在HPLC中应用的参照标准为系列烷酮：脂肪族甲基酮系列烷芳基酮系列1－硝基烷烃系列例：应用脂肪族甲基酮系列（丙、丁、戊、己、庚酮）对含黄酮类中药的指纹图谱进行定性，考察了柱温、流动相、色谱柱、HPLC仪等条件的微小变化对指纹图谱的影响，比较共有峰的保留时间、相对保留值和保留指数的RSD，结果保留指数的RSD是最小的。2025/5/2628第一章色谱基础理论样品样品+3~7个碳烷酮2025/5/2629第一章色谱基础理论三种定性参数比较保留值受色谱条件的影响大，通用性较差。相对保留值减少了色谱条件的影响，但对多组分的复杂样品，保留值差别较大，只选一种参照物误差较大。保留指数是国际公认的色谱定性指标。有很好的重现性和准确性。可利用文献的保留指数进行定性，而不需纯品对照。2025/5/2630第一章色谱基础理论此外保留指数还与温度、分子结构有密切关系：与温度有线性关系——由此可求出不同柱温下的保留指数（GC法）。例：某物的保留指数在100℃是654，150℃是688，则可求出125℃时的保留指数应为671。与分子结构有密切关系——可通过分子结构来预测保留指数或反之。2025/5/2631第一章色谱基础理论柱效率的参数（色谱峰的区域宽度）标准差（，standarddeviation)半峰宽（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基线宽度（peakwidth，W或Y）2025/5/2632第一章色谱基础理论标准差——在正态分布曲线中，将x=±1处（拐点）的峰宽之半称为标准偏差。在实际工作中,标准差为峰高0.607h处的峰宽之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607h

xx=0时，曲线的高度为峰高h2025/5/2633第一章色谱基础理论半峰宽——也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.355

，W1/2易确定，且比值大，故测量误差较小。h0.5hW1/22025/5/2634第一章色谱基础理论峰宽——也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截的距离,称为峰宽。对色谱峰两侧作切线后为等腰三角形，底边为峰宽，而为等腰三角形高度之半处的宽度之半，所以：W=4W

2025/5/2635第一章色谱基础理论

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355

，W=4=1.699W1/22025/5/2636第一章色谱基础理论差速迁移（differentialmigration）色谱过程是物质在相对运动着的两相间，分布平衡的过程。若混合物中二个组分的分配系数或吸附平衡常数不等，则被流动相携带移动的速度不等。因差速迁移——而被分离。2025/5/2637第一章色谱基础理论分配系数（partitioncoefficient，K）

在一定条件下，达到分配平衡后：样品组分在固定相中的浓度（Cs）样品组分在流动相中的浓度（Cm）

K=Cs/Cm

=K2025/5/2638第一章色谱基础理论K与保留时间（tR

）的关系：tR=t0

（1+K·Vs/Vm）t’R=t0

·

K·Vs/VmVs为色谱柱中固定相体积，Vm为色谱柱中流动相体积，即固定相间隙体积。分配系数大——柱上停留时间长物质的性质及色谱条件

K

tR2025/5/2639第一章色谱基础理论容量因子（capacityfactor，k’）

（保留因子retentionfactor，分配比partitionratio）k’表示平衡后组分在两相中的质量比。k’=K·（Vs/Vm），（K=Cs/Cm

）k’=（Cs·

Vs）/（Cm·

Vm）=Ws/Wm又根据t’R=t0

·

K·Vs/Vm，则有：k’=t’R/t0=tR/t0

-1tR=t0（k’+1）2025/5/2640第一章色谱基础理论色谱法最佳k’值范围可用k’值范围HPLC2～51～10GC～20.2～20TLC0.4～40.1～9色谱法中最佳分离条件与可用范围的k’值如表所示：根据tR=t0（k’+1），有：k’=0，tR=t0k’=1，tR=2t0

无保留2025/5/2641第一章色谱基础理论分离参数分离参数用于衡量分离条件的优劣，常用分离度，表示。分离度（resolution，R）R=即相邻两峰分开的距离是平均峰宽[(W1+W2)/2]的几倍。R大,分离效果好。2（tR2-tR1）W1+W22025/5/2642第一章色谱基础理论R=0.5tR2-tR1=2

，称为2

分离。分离后各峰露出的面积≥68.3%R=1.0称为4

（峰顶间距为4

），两峰峰基略有重叠，裸露峰面积≥95.4%R=1.5tR2-tR1=6

，称为6

分离（峰顶间距为6

），分离后各峰露出的面积≥99.7%R﹥1.5R﹥1.5，称为完全分离2025/5/2643第一章色谱基础理论例：混合物中两组分A和B在25cm长的色谱柱上的tR分别为16.40min和17.63min，而两个峰宽分别为0.555cm和0.605cm，纸速0.5cm/min,求分离度。2(tR2-tR1)W1+W2R==2（1.23）/2.32=1.06首先换算峰宽单位：

0.555cm/0.5cm=1.11min0.605cm/0.5cm=1.21min2025/5/2644第一章色谱基础理论影响分离度的因素分配系数比（

）容量因子（k’）柱效（n）

R=(4)·(-1

k2+1)k2)·(从三者对分离度R关系的公式看，

≠1是分离的前提。要将各组分分离，必须选择适宜的固定相、流动相流速、柱温等。2025/5/2645第一章色谱基础理论a为柱效项，b为柱选择性项，c为容量因子项。

=K2/K1=tR2’/tR1’=k2’/k1’,

在K1K2的前提下，柱效项与容量因子项越大，分离度越大。

abcR=(4)·(-1

k2’+1)k’2)·(2025/5/2646第一章色谱基础理论1.01.0011.011.1

1.21.52.0(-1)/00.0010.010.091

0.1670.330.501.01→1.1（9%↑），R（↑9倍）

1.5→2.0（33%↑），R(↑1.5倍)上表说明在1附近变化，对分离度R改善非常有效。2025/5/2647第一章色谱基础理论在＞1的前提下，柱容量k’值越大，R也越大。但当k超过20时，k’再增加，k

/（1+k

）增加不明显。一般k’不超过20。kk/（1+k）kk/（1+k）0.10.331.00.503.00.755.00.838.00.89100.91200.95300.97500.982025/5/2648第一章色谱基础理论假定n=50002025/5/2649第一章色谱基础理论假定k’=32025/5/2650第一章色谱基础理论假定a=1.12025/5/2651第一章色谱基础理论塔板理论把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板的间隔内，样品混合物在气液两相中达到分配平衡，经多次分配平衡后，分配系数小的组分（挥发性大的组分）先到达塔顶（先流出色谱柱）。由于色谱柱的塔板相当多，因此分配系数的微小差别就可获得很好的分离效果。在柱内一小段长度H内（相当于一个分馏塔），组分可以很快在两相间达到平衡，H称为理论塔板高度。2025/5/2652第一章色谱基础理论理论板数（n）与理论板高度（H）

n=（tR/

）2n=5.54（tR/w1/2）2n=16(tR/w)2n越大，柱效越高。如果用t’R计算理论板数，所得值为有效理论板数n有效2025/5/2653第一章色谱基础理论理论板数取决于：固定相种类、性质、填充状况、柱长；流动相及其流速；被测物性质等。理论板高

(H)H=L/nL为色谱柱长度，当L一定时，H与n呈反比，即H越小，柱效越高。2025/5/2654第一章色谱基础理论例：测得某一物质的保留时间为1.5min，半峰宽为0.2cm，柱长2m，记录纸速为2.0cm/mi