2021日本血吸虫抗体检测标准酶联免疫吸附试验法

DetectionstandardofantibodyagainstSchistosomajaponicum—Enzyme-linkedimmunosorbentassayWS/T792—WS/TWS/T792—日本血吸虫抗体检测标准enzyme-linkedimmunosorbentsolubleegg staphylococalprotein控温范围5℃～99.9℃，温度分辨率/波动度0.1℃/±0.5℃增量5μL。0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，制备方法见附录A.2含0.05%吐温-200.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS-T），制备方法见附录A.3%%pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液，制备方法见附录A.92mol/L硫酸，制备方法见附录A.11采集末梢血100μL或静脉血2mL，室温下放置至血块收缩后，800g离心5min，分离出血清进行100μL1:1000～1:30004℃100μL封闭液过夜，甩干。4℃保存备用。1:100100μL稀释血清加入酶标371h6.2.1洗涤甩干。371h6.2.1100μL3730min50μL以空白对照调零，450nm（TMB为底物）492nm（OPD为底物）OD630nm作为参比波长。0.05计算。附录即为0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，密封盖好，4℃保存备用，有效期2周。（PBS），再加0.5mL吐温-20，即配成含0.05-20的洗涤缓冲液（PBS-T），4称取2gBSA，加入PBS-T缓冲液100mL，即为2%牛血清白蛋白，4选择体重2.5kg～3.0kg的健康家兔，每只感染800条～1000条日本血吸虫尾蚴，饲养60d后，抽取选择体重2.5kg～3.0kg（56℃称取0.1gBSA，加入PBS-T缓冲液至100mL，4常用过碘酸钠法标记称取5mg辣根过氧化物（HRP）溶于0.5mL蒸馏水中加入新鲜配制的0.06室温放置30min后，加入含5mg纯化抗体的水溶液1mL，混匀并装透析袋，在0.05mol/LpH9.5碳酸缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，然后加5mg/mL硼氢化钠（NaBH4）溶液0.2mL，置4℃2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，4℃30min后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中，并透析过夜，次日离心除去不溶物，即得酶-抗体结合物，用磷酸盐缓冲液加至5mL进蒸馏水）50mL，即为pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液。现配现用。称取100mgTMB溶解在10mL二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇中，配成1TMB溶液，4℃保存69.9mL加入0.1mL1TMB1mLTMB溶液加入30%过氧化氢（H2O2）1μL，混匀后立即使用。称取4mgOPD溶解在10mL底物缓冲液中，再加30H2O215μL附录图B.1样本采集与保存：末梢血一般采用聚乙烯塑料管采集，塑料管孔径2mm，长度10cm。静脉血一般采用一次性真空采血管采集。全血采集后应在4h内进行血清分离。血清样本不能混有红细胞或被细菌污