药物分析学：样品前处理和药物提取技术

第三章样品前处理和药物提取技术

【体内药物分析】

1、体内样品的特点：采样量少；待测物浓度低；干扰物质多

2、体内药物分析的特点：体内样品需经分离与浓集，或经化学衍生化处理后才能进行分析;

对分析方法的灵敏度及专属性要求较高；分析工作量大

3、测定方法：色谱分析法，免疫分析法和生物学方法

第一节生物样品的采集、制备、贮存

体内样品的种类

生器官、组织

物

样

品r血液、尿液、唾液、乳汁、

体液精液、脑脊液、泪液、胆汁、

胃液、胰液、淋巴液、粪便等

二、体内样品的采集和制备

(一)血样——血浆、血清和全血

体现药物浓度和治疗作用之间的关系。最常用的生物样本。

1、血样的采集：注射器、毛细管眼陋采血、静脉插管手术、滞留针股静脉取血

<动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。

2、血样的制备：

测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。

(1)血浆(plasma)的制备

置含抗凝剂试管中血浆

静脉血2500~3000r/min

离心5Tomin

个抗凝剂：肝素(最常用)、EDTA、枸椽酸盐、草酸、氟化钠。

(2)血清(serum)的制备

37。€：01~室温放置拨去血饼

静脉血置无抗凝剂试管曳

30-60min

2500~3000r7mi?血清

离心5Tomin

<血浆比血清的分离快，而且制取的最约为全血的50%〜60%,血清只为全血的2()%~40%,

多数研究者用血浆进行分析测定。

(3)全血(wholeblood)的制备

热含抗凝剂试管中

静脉血全血

保持血浆和血细胞的匀相状态

令应用：若需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度；血浆内药物浓度波动太大,

且难以控制

令血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测

-最常用的生物样本。

（二）尿样

体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、I相及II相代谢物等多种形式排出。

用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代读物等

的研究测定。

1、尿样的特点

尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，但易受食物种类、饮水多少、排汗情况的影响。

一般以某一段时间或单位时间内尿中药物的总量（排泄量或排泄率）表示。

2、尿样的采集

采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。

（1）测定方式一一测定一定时间内排入尿中的药物总量

（2）样本采集一一时间尿（在规定时间区间内采集），并测量每次收集的尿液体积c

（三）唾液（saliva）

一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：

TDM中利用对S的测定代替对P的监测——药代动力学的研究

1、唾样的采集：在漱口后15min,安静状态下采集口腔内自然流出的唾液：也可在刺激下

快速采样（需注意干扰）。

（1）物理法（口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等）

（2）化学法（将柠檬酸或维生素C等置于舌尖）弃去初始部分后采集

2、唾样的制备：唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以30（）0rpm离心lOinin,

取上清液直接测定或冷冻保存。

（四）组织

用于在药物的动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，为药物的体内动

力学过程提供重要信息。

◊常用的组织：胃、肝、肾、肺•、心、脑等

I、组织样品的制备：制成匀浆溶液

2、组织样品的处理：沉淀蛋白法；酸水解或碱水解；酶水解法

（五）头发

可用于体内微量元素的含量测定：也可用于用药史的估计、临床用药物和非法滥用线物的

甄别

1、头发样品的采集：微最元素在前额部位的头发中含鼠最低，枕部含显最高，应从枕部取

样，采集时从发根部（靠近头皮约1cm处），剪取0.5-lg的头发

2、头发样品的洗涤：丙酮-水-丙酮

3、头发样品的处理：直接甲醇提取；酸水解（O.lmol/L盐酸）；碱水解（Imol/L氢氧化钠）；

酶水解（最常用）。

三、体内样品的贮存与处理

（一）最常用的方法——冷藏或冷冻

冷藏一冰箱（4℃）中一短期保存（1〜2d）

冷冻一冷柜（-20C）或低温冷柜（-80℃）中一在朗保住

令冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定

1、血样的贮藏

采集后及时分离血浆和血清（W2h）,分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再

贮存。

2、唾液样品的贮藏

（1）测定唾液pH时应在取样的当时测定。

（2）为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4c以下保存

（3）冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。

3、尿样的贮藏

采集后应立即测定（W24h）,若不能立即测定，加入防腐剂后保存。

保存时间为24~36h（4℃）或长期（-20℃）

（二）去活性

为防止含瓶样品在采样后酶对待测组分进一步代谢，采样后必须立即终止酶的活性。

<常采用的方法：液氮中快速冷冻、微波照射、匀架及沉淀、加入酶活性阻断剂（如氟化

钠、四氢尿甘、三氯醋酸）或抗氧化剂（如维生素C等）、样品煮沸。

第二节生物样品的预处理

一、游离药物浓度测定方法

1、平衡透析法：用半透膜只允许小分子药物通过，而不允许蛋白质等大分子物质通过的原

理而分离游离型药物。缺点为所需血样量较多，且耗时长。

2、超滤法：超滤法是以多孔性半透膜…超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术。在超滤法

中超滤膜是超滤技术的关神。超漉膜是一种具有不对称结构的多孔膜，膜的正面有一层起分

离作用的较为紧密的薄层，称为有效层，其厚度只占总厚度的几百分之一，其余部分则是孔

径较大的多孔支撑层。

3、超离心法

4、凝胶过滤法

二、生物样品分析前处理的目的

在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生

也等样品预处理过程一一为药物的最终测定创造良好条件。

（1）使待测药物游离一一测定药物的总浓度

（2）使样品纯化一一消除生物基质中内源性物质的干扰

（3）提高检测灵敏度一一适应和符合测定方法要求的灵敏度

（4）防止分析仪器的污染和劣化一一提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果

三、样品制备时应考虑的影响因素

1、药物的理化性质和存在形式

药物的酸碱性（pKa）、未电离分子的亲脂性、挥发性等物理参数

2、待测药物的浓度范围

3、药物测定目的

4、选用的生物样品类型

5、样品预处理与分析技术的关系

四、生物样品的预处理技术

(一)去除蛋白质法

目的：结合型药物释放、减少乳化的产生、保护仪器

常用方法：

1、溶剂沉淀法一一蛋白质脱水沉淀

(1)常用的有机溶剂一一乙口、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢吠喃等

(2)血样与溶剂的体积比——1：(1-3)——除去90%以上蛋白质

(3)离心分离---高速(>15000Xg)离心5min

(4)上清液pH——pH8.5-9.5

2、中性盐析法一一“盐析”沉淀蛋白质

(1)常用中性盐——饱和(NH4)2SO4、Na2so4、MgSO4、NaCRNa3P04等

(2)试剂用量——血样与饱和(NH4)2SO4的比例为1：2时——除去90%以上的蛋白质

(3)离心分离——高速离心2min

(4)上清液pH——pH7.0~7.7

3、强酸沉淀法一与蛋白质阳离子(钱基)形成不溶性盐沉淀

(1)常用的强酸一一10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏璘酸等

(2)试剂用量一一血清与强酸的比例为1：0.6时；除去90%以上的蛋白质

(3)离心分离高速(>10000r/min)离心l~2min

(4)上清液pH——pH0-4

4、热凝固法一一蛋白质受热变性

当待测物热稳定性好时可采用。通常可加热至90℃,只能除去热变性蛋白。

第三节提取分离及相关技术

【目的】

1、消除内源性物质、代谢物及其他共存物质的干扰；

2、提取浓缩待测物质，使其易于检测

【方法】

液-液萃取法(传统的方法)；固相萃取法(液一固萃取法)；自动化固相萃取；固相微萃取；超

滤；微透析技术

一、液一液萃取法(liquid-liquidextraction,LLE)

(1)溶剂的选择一一试验成功的主要条件(相似相溶原则)

考虑：提取效率和选择性；操作是否方便

①对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶

②沸点低、易挥发

③与水部相混溶

④无毒、不易燃烧

⑤具有较高的化学稳定性和惰性

⑥不影响紫外检测

(2)溶剂的用量

①萃取次数一一通常为I次(萃取R在70%以上)；必要时2~3次(萃取R在50%以下)

②每次用量一一和水相的体积比通常为1:1或2~5:1

③萃取方式涡流混合

（3）水相pH值

水相pH值一一药物的pKa确定一一90%以上的非电离形式

①碱性药物坡佳pH值:高于pKa值1~2个pH单位

②酸性药物最佳pH值:低于pKa值1~2个pH单位

③一般规则:碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取；

令生物样品宜在碱性或近中性提取一一生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取

二、离子对提取法

Q%（被测药物）+X-aq（反离子）QQXorg（离子对）

令影响提取效率的因素

（1）测定碱性药物时，一般用烷基磺酸类（RSO3H）作为反离子；如戊烷磺酸、己烷磺酸、

庚烷磺酸、辛烷磺酸、月桂磺酸等；

（2）测定酸性药物时，一般用烷基季铁类化合物（R4N--X）作为反离子，如四丁基铁、

四乙基钱、四辛基钱等。

（3）欲提高药物提取入有机相的量，应选择对离子对溶解度大的有机溶剂：常用的提取溶

剂为氯仿、二氯甲烷等。

三、固相萃取法（Solicbphaseextraction,SPE）

1、SPE原理一一将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，

由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当

溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。

2、洗脱方式

A:药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱

B:杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱

通常为A模式

3、固相的选择

原则一一固相与被测组分应具有相似的极性

SPE的填料种类繁多，可分成三类

I）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）

2）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）

3）离子交换型

4、试验步骤——五步

1）用甲醇活化填料

2）用水或适当的缓冲液冲洗小柱一一除去残留的甲醇

3）加样一一使样品经过小柱，弃去废液

4）用水或适当的缓冲液冲洗小柱一一除去残留的干扰物

5）选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱一一洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接

进行在线分析

5、方法特点

优点：1）引入杂质少

2）完全避免乳化的形成

3）较高萃取率、重现性较好

4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化

缺点：1）价格昂贵

2）技术要求高

四、固相微萃取技术（SPME）

五、湍流色谱（TFC）

1、由有孔的填料代替了无孔填料，当使用内径为1.0mm的柱子时，流速可以达到3-

5ml/min而柱回压（columnback-pressure）较低；且溶剂前沿峰呈现塞子样的轮廓而非抛物

线的形状，既非线性液流；这两个特点提高了渗透速率：可以尽快达到吸附平衡。

2、TFC是一种直接进样预处理技术，在对血浆和血清样品的处理上实用性很强，利用分子

排阻原理，使得大分子的生物基质成分与小分子药物得到很好分离。这样，样品的预处理过

程简化为离心后就可以直接进样处理。

3、TFC一般用于蛋白结合率总的样品，通常的样品不需要特殊的处理其回收率就能达到

70-100%,而与蛋白结合非常强的药物在进行TFC时要调低流速（0.5ml/min）或在萃取前

进行酸化.

六、膜萃取技术

利用膜在两相间的选择性屏障作用进行分离富集的方法。包括有孔膜萃取和无孔膜萃取

技术膜类型原理驱动力主要联用仪

透析有孔分子排阻浓度差LC

异

电透析有孔分子排阻和选择离电位差CE

子传输异

过流有孔分子排阻压力差LC

异

漠萃取无孔分配系数浓度差LC,GC,CE

异

七、微透析

目前微透析技术广泛应用于色谱分析，特别是在用毛细管电泳分析生物样品时。原理如下图

所示：

微注射泵三个,检测系统

―注射鼠（〉

渗析

八、超临界流体萃取

药物分析中广泛采用SEF与其它多种分析仪器联用技术。如:SFE-GC、SFE-HPLC、SFE-FTIR

（fouriertransforminfra-redspectroscopy,叶变换红外光谱）、SFE-NMR（nuclearmagnetic

resonance,核磁共振）、SFE-MS（massspectrography,质谱法）及SFE-SFC（supercriticalfluid

chromatography,超临界流体色谱法）联用等。

优点如下：

①回收率高，不易乳化

②分析速度快，适于批量处理

③适用范围广

④易于联用

⑤减少了有毒性的有机溶剂的使用

九、柱切换技术

柱切换技术可用于：

（1）样品沉淀蛋白后进样

（2）体液宜接进样（在线去蛋白）

（3）全血或组织匀浆直接进样

（4）其他联用：在线透析、在线衍生化等

第四节化学衍生化

某些药物或代谢物极性大、挥发性低或对检测器不够灵敏，使常规的HPLC或GC难以有效

测定需衍生化。药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化一一如R-COOH.R-OH.R-NHz.

R-NH-R'

。化学衍生化的目的

①使药物变成具有能被分离的性质

②提高检测的灵敏度

③增强药物的稳定性

④提高对光学异构体分离的能力等

1、GC法中的化学衍生化

主要衍生化反应：

a:烷基化

b:酰化

c:硅烷化一一应用最广泛

d：不对称衍生化：使对映异构体药物生成非对映异构体衍生物

2、HPLC法中的化学衍生化

⑴目的：

a:提高对样品的检则灵敏度

b:改善色谱分离效果

⑵化学衍生反应的要求

a.反应条件不苛刻、能迅速定量进行

b.生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测

c.衍生试剂方便易得、通用性好

⑶衍生化分类

柱前衍生法：是在色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。

柱后衍生法：是在色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反应液

进行反应，在线检测衍生化产物。

3、色谱分析法

(I)GC法中的化学衍生化法

①硅烷化常用于具有ROH、RCOOH.RNHR;等极性基因药物的衍生化。

-0H